ATCC细胞复苏和培养官方手册

细胞是我们很多基础研究的基础，那么细胞能否被成功复苏就尤为重要了。

美国菌种保藏中心， 又称美国模式菌种收集中心(ATCC)，是位于马里兰洲洛克菲勒的一家私营的，非赢利性组织。目前它可以提供各种动植物细胞、标准品、菌株达两万多种。以下是来自ATCC的官方说明。

收到细胞的注意事项

冻存的ATCC细胞株和杂交瘤细胞株在运送过程中使用干冰保持低温。收到冻存细胞后，可以立即解冻复苏，去除二甲基亚砜（DMSO）后进行细胞培养。如果不立即复苏培养细胞，必须将细胞冻存管放置于液氮罐存储。请不要将细胞存储在-130℃以上的温度。如果温度不够低，达不到-130℃，细胞活力会迅速下降。

对于浸没在液氮中细胞，在复苏时需要特别留意，如果在存储过程中冻存管出现泄露，液氮会缓慢的进入其中；这样在解冻的过程中，液氮的挥发可能会导致冻存管爆炸或将冻存管盖掀起，引起碎片飞溅非常危险。

安全防护：在从液氮中取冻存管以及解冻的过程中，要始终穿戴防护服、手套以及面罩。

产品说明书和质检报告（COA）

ATCC每个细胞株都有一份产品说明书（product sheet），其中包含细胞株的信息和详细的操作指南。细胞株的所有详细介绍可以在 ATCC 网站找到，产品说明书和COA也可以从ATCC网站下载。

冻存细胞的复苏和培养

1. 准备工作

先准备好细胞培养皿或细胞培养瓶，及产品说明推荐的相应细胞培养基。并在37℃水浴中预先温热细胞培养基。

2. 37℃水浴

小心取出装有细胞的冻存管，保持管盖拧紧，将冻存管盖以下的部分置于37℃水浴中并轻微的搅拌以帮助解冻。解冻过程应该尽快，大约短于2分钟或待最后一块小冰晶体刚融化，就应将细胞冻存管取出水浴。

（注意：一定要快速融化冰晶，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。所以，要避免水浴锅内冻存管太多，导致温度不够）

3. 消毒和无菌

在从水浴中取出的细胞冻存管表面喷洒70%乙醇配制的消毒剂，用无菌纸巾或纱布试干。之后的操作步骤都应该遵循在无菌条件下生物安全柜中严格操作。

注意：随时更换吸头和吸管，避免交叉污染。

4. 离心

小心拧开冻存管的顶部，将管内容物用1ml移液枪转移到含9毫升培养基的无菌离心管中。离心5到7分钟(125×g),小心吸去上清液以去除抗冻剂(二甲基亚砜)，避免丢失细胞沉淀。

注意：对于多数细胞系而言，不需要立即去除冻存液，通常可在复苏后8-24小时换液进行去除（但对于一些对冻存液敏感的细胞，我们就需要先进行细胞离心以除去冻存液）。

5. 重悬

将细胞沉淀重悬于配好的完全培养基中。将细胞悬液转移到培养容器，轻轻摇晃使细胞均匀的分布。

生长较慢的细胞株可重悬于5-8ml培养基并转移到T25培养瓶。生长较快的细胞株可重悬于12-20ml培养基并转移到T75培养瓶。ATCC网站有各个细胞株的具体生长状况及培养方法记载。

A. 复苏过程中应避免使用过度碱性的培养液（通常我们的培养液中都含有酚红作为pH指示剂，因此这里既尽量不要使用因偏碱而变紫的培养液）。建议事先将培养容器中加入培养液，置于培养箱中孵育不少于15min，以使培养液达到其正常的pH值，然后再加入冻存的细胞。

B.某些细胞系在解冻后，当过于快速的加入大量新鲜培养基时可能会出现渗透压休克。此时应使用20°C-37°C下多次、少量、逐步增加（每次1-2ml）新鲜培养液的方法，每隔10-20min添加一次新鲜培养液。

6. 培养

将细胞培养容器置于细胞培养箱，在温度37℃, 二氧化碳浓度5%的培养条件下进行孵育。细胞培养24小时后应在显微镜下观察细胞形态和生长状况。

为了确保细胞活力、遗传基因型稳定和表型的稳定，细胞株的培养需要保持在对数期。这意味着需要定期对细胞进行传代。并且注意在细胞进入生长平台期之前，即单层细胞100%汇合长满前或悬浮细胞达到其推荐的最大细胞密度之前，要进行细胞传代。监测细胞生长和绘制每个细胞株的生长曲线都有助于确定细胞株的生长特性。