2024-1-30 Day1

参考：https://zhuanlan.zhihu.com/p/620449565

https://zhuanlan.zhihu.com/p/420137652?utm_id=0

一、基本原理

利用 siRNA（small interfering RNA）进行基因表达的敲低。

RNAi 包括 shRNA 与 siRNA。siRNA 是化学合成的短双链 RNA，易降解，结构较为不稳定，需要-20℃妥善保存，避免剧烈震荡及涡旋。

二、设计流程初览

总结：①siRNA 针对的是 mRNA 序列，为了保证其与靶向序列结合，设计区域有一些要求；

②为了siRNA 序列的稳定性，3 端增加两个 T，且需要注意 GC 比例；

③多设计几条，实际操作后挑选效果好的；

④设计完之后先验证再订购。

三、实操

1.NCBI 获取目的基因信息

网站：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

选择 gene（顺序按字母先后索引），输入目的基因，选择需要的物种（人 homo sapiens、小鼠 mus 等）

向下划，找到 RefSeq 模块

包括 NG（DNA 基因组）、NM（mRNA）→NP（蛋白质），包括了不同剪接的转录本，这里选择 NM 复制粘贴，可以选择个人需要的保守区的不同转录本，这个 NM 开头的序列被称为 Accession number

Accession number还可以在赛默飞官网验证：https://www.thermofisher.cn/

结果中会出现商品化的 siRNA，不能看到具体序列，但可以看到 NM 序列与 NCBI 中基本一致

2.赛默飞 siRNA 设计工具：

网址：https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/

输入 Accession number

可以按自己要求调整物种，GC 比例，一般按默认

获得结果，可以记录下星级最高的几个，注意这里的序列是 dsDNA 模板，如果需要直接在赛默飞网站内订购，进行下一步操作；

选择想要的序列，✅，会出现订购界面，选择其中的 tube，如果没有阴性对照 scramble RNA，则也勾选下面的 control，一般在第三方公司订购填写订单后会赠送对照 RNA；

选择 email/save order 会显示出双链 RNA 序列

TT 序列的添加：还没弄明白，使用了已有的序列，交给订购公司后，公司会自动加上 TT，不同公司可能不同，需要结合具体情况。

3.验证（已有已知序列可直接跳至本步）

由Blast 验证：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

Blast 总体来说是一个生物数据库，存储了物种的遗传信息，并进行比对分析，可进行引物验证等操作；

输入刚刚获得的目的DNA 模板，并且选择正确物种，目前只有人和小鼠的数据库：

注意：选择最下面的√方便对多条序列验证，分别打开新的窗口

获得结果，速度一般比引物验证快；

4.订购与后续交流

选择合适的公司本地经销商，以电子邮件形式发送，会再次确认信息无误，沟通快递方式，等待接收与后续实验。价格为 700 元两条，赠送一条对照 RNA。

后续实验检验敲低效率。siRNA 敲低较构建敲除细胞系容易操作，时间也较短。