震惊！未成熟的NK细胞可以促进三阴性乳腺癌的进展

前言

乳腺癌是女性最常见的肿瘤，是美国女性肿瘤相关死亡的第二大原因，据估计，2020年即有27.5万多例新病例报告。三阴性乳腺癌（Triple-negative breast cancer，TNBC）占所有乳腺癌亚型的10%至15%，其特点是缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体（HER2），正是因为这些特点，TNBC对目前的常见靶向治疗方案不敏感。另外，TNBC的复发率和转移率也高于其他亚型的乳腺癌，与更差的预后相关。

TNBC的肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）不同于其他亚型，其中大量的肿瘤浸润免疫细胞可能通过调节肿瘤细胞增殖、凋亡，促进血管生成、免疫抑制和耐药性产生进而推动肿瘤进展。研究者们已经发现，TNBC中的免疫细胞表型与预后相关，提示针对这些免疫细胞的其他治疗方法有可能改善TNBC患者的预后。尽管免疫检查点抑制剂已在许多种实体瘤患者中证明可以延长其生存期，但在TNBC中的作用非常有限。此外，最近使用抗PD-L1抗体与化疗结合的3期临床试验IMpassion130和IMpassion131进行对照发现，深入了解TNBC的异质性免疫特征有利于开发靶向免疫细胞的免疫调节药物。

NK细胞通常被认为是抗肿瘤免疫反应的主要力量，但NK细胞的功能受其活化和成熟状态的影响。值得注意的是，一些不表达CD27或CD11b的NK细胞(CD11b^-CD27^-NK细胞)已经被报道与肺癌和肝癌的肿瘤进展相关，然而，它们的功能仍然未被充分研究。同样的，在TNBC中，存在着一群未成熟的NK细胞，并与这类患者的较差预后相关，但其与TNBC肿瘤进展的潜在关系迄今尚未得到充分表征。

在本研究中，作者利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，发现了一群独特的未成熟NK细胞亚群(CD11b^-CD27^-Socs3^high)存在于TNBC的TME中，并且与肿瘤进展和转移相关。此外，作者还利用一种创新的小鼠模型，进一步表明了这群NK细胞促进小鼠的肿瘤进展。通过耗竭这些细胞或抑制其Wnt配体分泌来阻止错误的细胞信号传导，可以减缓肿瘤的进展，这表明，这群未成熟的NK细胞可能是TNBC患者的潜在治疗靶点。

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主要内容

一、scRNA-seq分析揭示小鼠TNBC肿瘤微环境中的NK细胞亚群

首先，作者使用基于C3-T抗原（C3-T⁺）的高自发转移率的TNBC小鼠模型，通过scRNA-seq分析，识别了在侵袭性和转移性TNBC（C3-T⁺；Elf5^+/−，以下简称为C3-HET）以及非侵袭性和低转移性（C3-T⁺；Elf5^+/+，以下简称为C3-WT）原发肿瘤中的各种肿瘤和免疫细胞亚群。作者使用CD45抗体将免疫细胞（CD45⁺）与肿瘤细胞和成纤维细胞（均为CD45^-）进行区分，首先鉴定出10个CD45^-细胞簇（簇0~9）(图1A)，其中包括6个上皮细胞簇（簇0、1、2、3、4和9）、4个成纤维细胞和脂肪细胞簇（簇5、6、7和8）。接下来对上皮细胞簇之间差异表达的基因进行基因富集分析（GSEA）显示，与在C3-WT中丰度较高的簇9相比，在C3-HET中丰度较高的簇0、1、2、4显著富集了与上皮-间质转化(EMT)、糖酵解和缺氧相关的基因集(表S1)。这些数据揭示了C3-HET肿瘤活跃的代谢状态和潜在的EMT样倾向。与C3-WT相比，C3-HET肿瘤细胞簇中肿瘤干细胞和EMT标志物的表达显著升高(P＜0.0001)，表明这些肿瘤细胞具有干细胞样特性、侵袭性和EMT样的状态(图1C-E)。

为了进一步确定上述发现的潜在临床相关性，作者将自己的数据与已发表的生存期较短的TNBC患者的scRNA-seq数据进行对比，发现了人类TNBC肿瘤的低Claudin基因标志和此研究中的C3-HET肿瘤细胞标志之间的几点相似。最近的另一项研究使用了人类TNBC的scRNA-seq数据，证明了其肿瘤细胞群高度富集了关于鞘糖脂代谢、溶酶体功能、固有免疫感知和炎症的基因，同样与侵袭性疾病表型(如转移和不良预后)相关。与C3-WT相比，鞘糖脂通路基因集也在C3-HET肿瘤细胞中富集。为了进一步验证鞘糖脂代谢途径对肿瘤细胞的影响，作者用2μM芬戈莫德(FTY720)，即鞘氨醇-1-磷酸受体(S1PR1)的拮抗剂，处理Epcam⁺C3-HET肿瘤细胞。作者观察到FTY720处理后肿瘤球形成减少，表明鞘糖脂代谢途径在TNBC肿瘤形成中发挥了支持作用。

接下来对免疫细胞群进行分析，作者发现，CD45⁺免疫细胞群在C3-HET肿瘤中由15个不同的簇组成，包括髓系细胞、NK细胞、树突状细胞、T细胞和巨噬细胞(图1F)。与C3-WT相比，C3-HET中的髓系细胞群更少。表达Nkg7的NK细胞和自然杀伤T(NKT)细胞在两种基因型之间有大量的差异表达基因，表明这些细胞表型可能发生了改变。T细胞在两种基因型之间无显著差异。此外，对表达Nkg7的细胞进行进一步聚类，鉴定出了5个NK和NKT细胞亚群，其中亚群4代表NKT样细胞，因为它们高表达CD3e和CD3g(图1G)，在进一步的NK细胞鉴定中被排除。对总NK细胞群的进一步分析显示，与C3-WT中的NK细胞相比，C3-HET中的NK细胞标志细胞毒性和NK细胞活化的基因表达较低。此外，通过对亚群分析显示，各种颗粒酶的标志在NK细胞亚群0和1中的表达较低（图1H），表明这两个亚群包含具有较低细胞毒性的NK细胞群。然而，GSEA分析指出C3-HET中的NK细胞具有更强的炎症反应，表明它们可能在TNBC的TME中具有促炎作用。

二、TNBC相关NK细胞是未成熟的并与PD-L1表达、血管生成和转移增加相关

通过流式细胞术对TNBC相关NK细胞进行分析显示，与C3-WT相比，C3-HET中的CD45⁺CD3^-DX5⁺NK细胞的数量更多（图2A、B），通过使用抗NK1.1抗体进行免疫组化实验可以进一步证实（图2C、D）。C3-HET中的CD34和血管内皮生长因子（VEGF）（血管生成的标志物）的表达减少，进一步支持了它们本身的功能。PD-L1在C3-HET中显示高度表达。此外，在携带C3-HET肿瘤的小鼠的肺转移部位也观察到NK细胞数量增加，支持NK细胞和TNBC转移之间的关联。

通常，小鼠NK细胞根据CD27和CD11b在其表面的表达可以分为四个功能不同的亚群，这反映了它们的成熟状态。CD11b^-CD27^-NK细胞与免疫调节相关，可产生更多的细胞因子，而CD11b⁺CD27^-细胞具有更强的细胞毒性。作者发现，与C3-WT相比，C3-HET原发性肿瘤中未成熟的CD11b-CD27-NK细胞数量增加（图2E、F）。尽管这些NK细胞与ILC1s有一些相似之处，但通过流式细胞术和scRNA-seq分析显示，ILC1s的比例在C3-WT和C3-HET之间并没有差异（图2G-I）。

三、耗竭NK细胞可以减缓TNBC肿瘤进展和转移

为了显示肿瘤相关NK细胞在TME中的重要功能，作者使用抗NK1.1抗体（250μg/小鼠，3次/周）将处于生长阶段（12至15周）的C3-HET小鼠中的NK细胞去除（图3A）。结果显示NK细胞减少导致肿瘤发生和进展显著降低（P=0.0106）（图3B、C）。但原发性肿瘤的进展减缓也与肿瘤细胞凋亡的增加有关，这一点已被分裂的caspase-3+细胞数量的减少所证实（图3D）。此外，NK细胞耗竭导致CD8+细胞毒性T细胞减少（图3E）、肿瘤细胞中PD-L1表达减少（图3F），表明这一耗竭过程影响了免疫抑制途径。与对照组相比，注射了抗NK1.1的小鼠腋窝淋巴结中的K14⁺（图3G）和Vimentin⁺（图3H）单细胞转移也显示减少。总之，这些数据强烈提示肿瘤相关NK细胞在TNBC发生和转移中可能发挥重要作用。

为了进一步了解肿瘤相关NK细胞在肿瘤进展中的功能，作者将肿瘤细胞原位植入C3/Tag-REAR（以下称为REAR）小鼠，该小鼠携带包括NK细胞在内的所有功能性免疫细胞，但与携带C3-T抗原的小鼠相比，在相同大小和年龄小鼠中，REAR小鼠中的肿瘤形成更快。结果显示，将C3-HET或C3-WT肿瘤细胞原位植入后形成的肿瘤在形态上与原发性自发性肿瘤相似，并且C3-HET肿瘤细胞比C3-WT肿瘤细胞生长得更快。当C3-HET肿瘤较小（约15_{30mm3；初始）或已形成（约65}150mm3；与TNBC的临床进展相匹配）时，用抗NK1.1抗体去除NK细胞，都可引起肿瘤的发生减缓。作者还观察到在NK细胞发生耗竭的C3-HET原位肿瘤中，分裂的caspase-3+凋亡细胞的数量增加（图4F）、CD34⁺血管生成的数量减少，这些发现表明NK细胞的减少可能影响原发性肿瘤中的细胞凋亡和血管生成。NK细胞减少后，F4/80⁺巨噬细胞和CD4⁺T细胞的数量也减少，但CD8⁺T细胞群的数量没有发现显著变化。NK细胞的耗竭同样也不改变CD49a⁺CD127⁺ILC1细胞群的数量。此外，NK细胞耗竭导致C3-HET肿瘤细胞中PD-L1表达显著减少（P=0.0008）（图4I），表明NK细胞促进PD-L1相关的免疫逃避发生。

四、TNBC相关NK细胞是非细胞毒性的并通过激活WNT信号促进肿瘤干细胞特性

为了评估TNBC相关NK细胞的促肿瘤功能，作者将其与TNBC和非TNBC细胞系进行共培养。结果显示，与分选的C3-HET NK细胞（CD45CD3^-Dx5⁺）共培养12小时后，通过碘化丙锭染色测量，4T1TNBC细胞系的细胞活力没有改变。作者发现，在共培养72小时后，与单独培养的肿瘤细胞相比，C3-HET来源的NK细胞增加了肿瘤球的数量和大小，而C3-WT来源的NK细胞对肿瘤球没有产生影响（图5C、D）。与单独培养的TNBC细胞相比，与C3-HET来源的未成熟NK细胞【CD3-DX5⁺CD11b^-CD27^-（定义为Q3）】的共培养也导致TNBC肿瘤球的数量增加（图5E、F）。与Q3 NK细胞共培养的WTB细胞（从转基因小鼠MMTV-PyMT肿瘤中建立的管腔细胞系）肿瘤球的形成没有发生显著变化（P=0.0881），表明这些肿瘤相关NK细胞的功能具有TNBC亚型特异性。

为了验证这群NK细胞促进肿瘤干细胞特性，作者对C3-WT和C3-HET来源的NK（CD45⁺DX5⁺）细胞进行了批量mRNA测序（mRNA-seq）。结果发现，C3-HET来源的NK细胞中最显著下调的途径是与颗粒酶介导凋亡信号传导和细胞溶解相关的途径（图5I），这与前述的scRNA-seq数据分析结果一致（图1）。与C3-WT相比，C3-HET中颗粒酶（图5J）、NK细胞细胞毒性功能的相关基因（图5K）和杀伤细胞凝集素样受体（图5L）的基因表达减少，进一步支持了前述的数据分析结果。

此外，对前述scRNA-seq中的肿瘤细胞进行GSEA分析，可以观察到与C3-WT相比，C3-HET中Wnt/β^-连环蛋白信号传导的上调（图6A）和Wnt靶基因的高表达（图6B）。此外，通过对mRNA-seq的分析，作者发现与C3-WT相关的NK细胞相比，C3-HET来源的NK细胞中几个WNT配体的表达显著上调（图6C）。因此，作者通过qRT-PCR进行证实，与C3-WT相比，当肿瘤细胞与C3-HET相关的NK细胞共培养时，肿瘤细胞中WNT靶基因如Axin2、Ccnd1和Ascl2上调（图6D）。Wnt通路在调控与干细胞相关的分子和细胞特征中发挥着重要作用，因此，WNT配体在TNBC相关NK细胞中的高表达为NK细胞可促进肿瘤干细胞特性的功能提供了潜在的机制基础。为了验证Wnt信号在TNBC肿瘤细胞中的作用，作者在4T1 TNBC细胞与C3-HET相关的NK细胞共培养时添加泛Wnt抑制剂JW-74，结果显示逆转了NK细胞介导的肿瘤球数量增加（图6E）。

为了确定肿瘤细胞中的Wnt信号传导是否被肿瘤相关NK细胞分泌的Wnt配体激活，作者使用了基于慢病毒的Wnt载体，Top-dGFP和7TGC，建立稳定表达载体基因的EpRas细胞系（EpRas-7TGC或EpRas-Top-dGFP）。将从C3-HET中分选的NK细胞与表达EpRas-Top-dGFP(图6F)和EpRas-7TGC(图6G)的肿瘤细胞共培养，与对照组相比，这些细胞中的Wnt信号通路[绿色荧光蛋白阳性(GFP+)细胞]被激活，证实NK细胞介导的Wnt信号通路在TNBC中被激活。为了评估Wnt信号通路对TNBC肿瘤进展的影响，作者使用了LGK-974，一种影响Wnt配体分泌的Porcupine抑制剂。将来自C3-HET肿瘤的原代肿瘤细胞注射到REAR小鼠体内，一旦肿瘤形成（约65至150 mm3），即对荷瘤小鼠予以口服的LGK-974（5mg/kg）进行处理。与对照组相比，在LGK-974处理组中可观察到原发性肿瘤生长减缓。此外，作者还观察到LGK-974处理后肿瘤细胞中的干细胞基因出现下调，支持前述的发现，即NK细胞激活肿瘤细胞中的Wnt信号进而导致TNBC的肿瘤干细胞性增加。

五、NK细胞靶向治疗联合免疫治疗或化疗可改善TNBC的治疗反应

作者发现，与单独使用的PD-L1抑制剂相比，抗NK1.1和抗PD-L1抗体的联合使用可使C3-HET肿瘤进展减缓（图7A、B），并导致小鼠腋窝淋巴结中K14+单细胞转移减少。通过流式细胞术可进一步证实（图7C）。与对照组相比，抗PD-L1和抗NK1.1抗体的联合治疗导致原发性肿瘤中肿瘤细胞凋亡增加和血管生成减少。除此之外，作者还观察到NK细胞耗竭可改善化疗药物奥拉帕尼的治疗效果（图7D、E），该药物由美国食品药品监督管理局批准，用于辅助治疗具有种系BRCA（Breast CAncer基因）突变的高危早期乳腺癌患者。在两者联合治疗中可观察到肿瘤细胞凋亡和CD8⁺T细胞浸润增加。同时，作者还研究了使用Wnt配体分泌抑制剂LGK-974阻断Wnt信号传导的效果。结果发现抗PD-L1和LGK-974的组合比单独抗PD-L1抗体更有效，可明显减缓肿瘤进展（图7F-H）。

六、SOC3high未成熟CD56⁺NK细胞与TNBC患者不良临床预后相关

为了将从实验小鼠模型中收集的数据与TNBC的临床信息进行关联，作者使用大型数据集，如TCGA数据库中的KM plotter在线生存分析网站进行计算机分析。人类肿瘤中的NK细胞表达由NCAM1基因编码的CD56蛋白。我们发现ER^-的肿瘤患者中，OS和NCAM1表达之间呈现负相关；而在ER⁺的肿瘤患者中，OS与NCAM1表达之间无关(图8A、B)。在有淋巴结转移的ER-肿瘤患者(图8C、D)、化疗后的ER-肿瘤患者和临床III期的ER-肿瘤患者中，NCAM1高表达与较差的OS和较差的无远处转移生存期相关。综上所述，这些发现表明NCAM1高表达与TNBC肿瘤患者的不良临床预后相关。

为了确定CD56（NCAM1）与患者生存率之间的相关性是否呈现在蛋白质水平，作者进行了IHC分析TNBC（n=17）和非TNBC（n=16）患者的原发性肿瘤切片。结果显示，与非TNBC肿瘤患者的肿瘤相比，TNBC肿瘤的TME中存在更多的CD56+NK细胞（P=0.0392）（图8E、F）。进一步对具有患者生存信息的TNBC肿瘤切片的分析显示，生存期短（＜6年）的患者与生存期长（≥6年）的患者相比，其TME中含有数量相对较高的CD56+NK细胞，尽管这种差异没有统计学意义（P=0.0790 图8G、H）。在TNBC和非TNBC新鲜原发性肿瘤样品中，这些肿瘤相关的NK细胞大多数都是CD56⁺CD27^-CD11b^-的（图8J、K）。此外，当与非TNBC相关的NK细胞相比时，TNBC来源的CD56⁺NK细胞中SOCS3的表达更高，与前述的scRNAseq数据分析结果相符（图8L）。

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小结

本篇文章的故事线：

NK细胞近年来受到广泛关注，它不但可以直接杀死肿瘤细胞；而且可以迅速对肿瘤细胞作出反应，表达多种细胞因子和趋化因子，从而募集其它免疫细胞和促进T细胞和B细胞的适应性免疫反应。然而，并不是所有成熟状态的NK细胞的功能都是一致的，未成熟的NK细胞存在于TNBC患者的组织样本中，并与这类患者的预后较差相关。

作者首先通过scRNA-seq测序，证实了一个独特的未成熟细胞亚群（CD11b-CD27-SOCS3high）存在于TNBC的TME中，并与肿瘤进展和转移相关。在功能上，这些肿瘤相关NK细胞表现出颗粒酶介导的细胞溶解表达谱降低和Wnt16配体表达增加的特点。作者还发现这些肿瘤浸润NK细胞通过上调肿瘤细胞的Wnt信号促进了TNBC的肿瘤干细胞特性。此外，作者还通过联合去除NK细胞或抑制Wnt分泌的治疗与抗PD-L1抗体或奥拉帕尼的免疫治疗或化疗，可以减缓肿瘤进展。最后，分析从患者样本中收集的数据显示，较高的CD56表达与TNBC患者较低的总存活率（OS）之间相关。总之，作者通过结合临床前小鼠模型研究和患者样本数据分析确定了未成熟NK细胞亚群在TNBC中的功能。未来，NK细胞亚群也许可以作为TNBC患者的免疫治疗靶点。

研究观点：

这项研究对TNBC患者的治疗来说，可能是一个改变“游戏规则”的发现。对免疫治疗或化疗的耐药性是TNBC患者面临的最大问题，很少有人对目前的治疗有良好的反应。因此，寻找更好的药物靶点对提高生存率至关重要。这项研究可能会为实现这一目标铺平道路，研究指出耗竭未成熟的NK细胞会使肿瘤对化疗和免疫疗法敏感，将为今后TNBC的有效治疗开辟新的治疗途径。