转染原代BMDM细胞技术分享

影响影子：IF:12.40
发表期刊:Theranostics
Doi: 10.7150/thno.66420

原文标题：5-aza-2′-deoxycytidine potentiates anti-tumor immunity in colorectal peritoneal metastasis by modulating ABC A9-mediated cholesterol accumulation in macrophages。

背景：5-aza-2'-脱氧胞丁胺（5AZA），是一种DNA甲基转移酶（DNMT）抑制剂，可激活肿瘤适应性免疫，抑制肿瘤进展。然而，5Aza调节肿瘤免疫微环境的分子机制仍不完全清楚。

方法：研究了5AZA在结直肠癌（CRC）的腹膜癌（PC）免疫微环境中的作用。 通过流式细胞仪，实时PCR，Western印迹测定法和药物亲和力响应靶标稳定性（DARTS）研究了5AZA对巨噬细胞激活的影响。 5AZA对CRC患者的基质巨噬细胞和T细胞中验证了5AZA对肿瘤免疫力的影响。

结果：5Aza可以刺激巨噬细胞向M1样表型的激活，并随后刺激转移前脂肪组织中T细胞的激活，最终抑制免疫功能小鼠模型中的CRC-PC。从机制上讲，5Aza刺激原代小鼠巨噬细胞向M1样表型发展，其特征是p65磷酸化和IL-6表达增加。此外，我们筛选并鉴定了ATP结合盒转运蛋白A9（ABC A9）作为5Aza的结合靶标。5Aza以ABC A9依赖的方式诱导胆固醇积累、p65磷酸化和IL-6表达。NF-κB的药理学抑制或IL-6的遗传耗竭消除了5Aza在小鼠中的抗肿瘤作用。此外，常规化疗药物5-Fu或OXP协同增强了5Aza的抗肿瘤作用。最后，我们验证了5Aza在CRC患者基质巨噬细胞和T细胞抗肿瘤免疫中的重编程作用。

结论：综上所述，我们的发现首次表明5AZA通过调节巨噬细胞依赖性的T细胞激活前分散微环境中抑制了CRC-PC，同时抑制了CRC-PC。发现了5AZA在调节ABC A9相关的胆固醇代谢和巨噬细胞激活方面的DNA甲基化独立机制。

文章引用：

Small interfering RNA (siRNA)-mediated gene silencing

We used transfection reagent (#AD600150, ZETA life, USA) to transfect specific siRNA of ABC A9 into cells to silence their expression according to the manufacturer’s protocol. Briefly, macrophages were placed in a 6-well plate with a density of 2.5 × 105 cells. Transfection was performed when the cell density was 70%. 10 µL of siRNA (100 pmol/mL) and 10ul of transfection reagent were mixed at room temperature for 15 min, and then added into a 6-well plate containing 1ml of normal DMEM. After 24 h, theculture medium was removed and fresh DMEM medium was added to continue culture.

文章转染BMDM细胞方法总结

我们使用转染试剂（＃AD600150，ZETA life，USA）将ABC A9的特定siRNA转染到细胞中，根据制造商的规程使其表达沉默.简而言之，将BMDM巨噬细胞放在6孔板中，密度为2.5×105细胞。 当细胞密度为70％时，进行转染。 在室温下混合10 µL siRNA（100 pmol/mL）和10 ul转染试剂并静止15分钟，然后加入含有1ml正常DMEM的6孔板中。24小时后，除去培养基并添加新鲜的DMEM培养基以继续培养24小时后收细胞。

引用产品

AD600150，Advanced DNA RNA transfection reagent（Advanced DNA RNA转染试剂）；

热门产品

AV500150，小动物活体转染试剂Advanced DNA RNA；P400150，Sirius DNA转染试剂；Z7181FBS-500,胎牛血清（乌拉圭血源）；Z7010FBS-500,胎牛血清（澳洲血源）；BM0001-100，双抗;BM0002-100，0.25%胰酶;

ZETA life转染试剂简介： 

 2018年ZETA life公司与美国加利福尼亚大学旧金山校区联合开发用于哺乳动物细胞、活体动物转染的Advanced DNA RNA第三代多肽小分子转染试剂，此技术成为新的全球蛋白功能、免疫细胞及干细胞研发及生产的主要关键技术之一。ZETA life，Advanced DNA RNA转染试剂优势：

1.第三代多肽小分子转染试剂进入细胞后可几小时内快速被代谢对细胞不毒素影响;

2.可转染极度难转染的免疫细胞，悬浮细胞，原代细胞、干细胞等；

3.使用ZETA life转染试剂已发表文章的转染细胞名称：THP-1、RAW264.7、小鼠小胶质细胞BV-2、小鼠脑神经瘤细胞（N2A)、悬浮淋巴白血病细胞K562；原代骨髓巨噬细胞(BMDM)、脂肪间充质干细胞(ADMSCs)、造血干/祖细胞(HSCs/HPCs)、原代精原干细胞(SSCs)、原代大鼠肝细胞（Hepatocytes ）、原代子宫内膜上皮细胞(BEECs)、原代牛乳腺上皮细胞 (BMECs)、原代鸡胚肝细胞（CEHs）；NIH-3T3、人正常肝细胞 LO2、猪肾细胞PK-15、人舌鳞癌细胞SCC-25，CAL27；结肠癌细胞（HCT-116 SW480 HT-29）等。