白芍-麦冬药对治疗干燥综合征的科学基础

摘要：目的 运用网络药理学和分子对接探究白芍-麦冬药对治疗干燥综合征（sjögren syndrome，SS）的作用机制。方法 通过BATMAN、Gene Cards、OMIM、Drug Bank、TTD、DISGENET数据库和Cytoscape软件发现并探究相关治疗靶點作用关系。通过String数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用网络图。通过DAVID平台进行GO与KEGG富集分析。使用AutoDock Tools1.5.7软件进行分子对接。结果 白芍-麦冬有57个有效活性成分，362个作用靶点，SS有1219个疾病相关靶点。主要有效成分为豆甾醇、没食子酸、β-谷甾醇，核心靶点AKT1、IL1B、CAT、IGF1。GO分析中，GO生物过程（biological process，BP）主要包括基因表达的负调控、脂多糖的反应、RNA聚合酶II启动子转录的正向调节等；GO细胞组分（cellular components，CC）主要包括细胞表面、细胞外区域、细胞外体等；GO分子功能（molecular function，MF）主要包括血红素结合、类固醇结合、RNA聚合酶II转录因子活性等。KEGG富集分析中主要包括MAPK信号通路、TNF信号通路、cAMP信号传导途径等；分子对接实验表明其主要活性成分与核心靶点之间存在良好的结合活性。结论 白芍-麦冬药对通过多靶点、多通路发挥治疗SS的作用。

关键词：网络药理学；分子对接；白芍-麦冬；干燥综合征

干燥综合征（sjögren syndrome，SS）是一種以唾液腺、泪腺等分泌腺受累为主要特征的自体免疫疾病，临床上以眼干、口干等为主要特征。目前SS具体发病机制尚未十分明确，但有研究表明其病因与免疫、遗传、环境、性激素水平、细胞免疫、体液免疫等多种因素的交互作用有关，过度的炎症反应和免疫损伤是导致SS的重要原因。中国人群中SS的患病率为0.29%～0.77%，好发年龄为30～60岁，女性多见，男女比为1∶9～1∶10。目前西药治疗SS只能改善症状、延缓疾病的和发展，并不能根治。除此之外西药在治疗SS的过程中不良反应、副作用较多。刘健教授研究发现临床上常用白芍、麦冬治疗SS，且有良好的治疗效果。本文利用网络药理学的方法，探讨白芍-麦冬在SS的治疗机理上的独特优势，并运用分子对接对其进行验证，为白芍-麦冬药物治疗SS提供了新的理论基础。

1 材料与方法

1.1 白芍-麦冬药对成分的获取及相关靶点筛选 在BATMAN数据库中分别输入“baishao”、“maidong”，以参数分数大于20（Scorecutoff>20）且P值<0.05（AdjustedP-value<0.05）作为筛选指标，筛选出白芍、麦冬的有效成分和作用靶点。

1.2 SS相关靶点筛选及白芍-麦冬治疗SS的潜在作用靶点的获取 以“Sjögren syndrome”为关键词，分别在GeneCards（http：//www.genecards.org/）、TTD数据（http：//db.idrblab.net/ttd/）、OMIM数据库（http：//www.omim.org/）、DISGENET数据库（http：//www.disgenet.org/）、DrugBank数据（http：//www.drugbank.ca/）中检索，获得疾病相关靶点。运用venny 2.1.0在线绘制韦恩图，得到白芍-麦冬治疗SS的潜在作用靶点。

1.3 构建白芍-麦冬有效成分-作用靶点网络图 将1.1和1.2中所获得数据导入Cytoscape3.9.1软件中，构建白芍-麦冬有效成分-作用靶点的网络图。

1.4 PPI网络构建白芍-麦冬药对治疗SS的核心靶点筛选 将药物靶点与疾病靶点取交集，筛选出“白芍-麦冬”药对治疗SS的相关靶点，并在STRING数据库（https：//string-db.org/）中构建蛋白——蛋白互作网络，物种选择“Homo sapiens”，等值置信度为0.4，其余参数设置为默认值，保存结果中的csv.文件。用Cytoscape3.9.1软件构建可视化网络，并通过软件中的CytoNCA插件进行网络拓扑分析，筛选出核心靶点。

1.5 GO和KEGG通路富集分析 在DAVID数据库中，将物种设置为“Homo Sapiens”，对其共同靶点进行GO和KEGG富集分析。在GO富集分析中获得生物过程（Biological Processes，BP），分子功能（Molecular Functions，MF），细胞成分（Cellular Components，CC）的分析结果，并筛选P值最小的前10个结果进行研究。在KEGG富集分析结果中筛选P值最小的前20个通路，通过微生信平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）进行可视化处理。

1.6 分子对接验证 筛选出来的疾病关键靶点和药物主要活性成分分别作为受体蛋白和配体小分子。在PDB数据库（http：//www1.rcsb.org/）中获取受体蛋白的3D结构并下载其pdb格式文件，从UniProt（https：//www.uniprot.org/）数据库下载配体小分子的sdf格式文件，并在Open Babel软件中将小分子的sdf格式转化成pdb格式作为分子对接的配体。使用AutoDock Tools 1.5.7对配体和受体进行分子对接，并使用Pymol将分子对接结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 “白芍-麦冬”药对有效成分及相关靶点的获取 在BATMAN数据库中筛选后得到白芍35个有效成分，300个作用靶点，删除重复项后得到144个作用靶点；麦冬22个有效成分，305个作用靶点，删除重复项得到243个作用靶点。两种药物共有387个作用靶点，删除重复项后得到362个作用靶点。

2.2 SS相关靶点的筛选及白芍-麦冬治疗SS的潜在作用靶点的获取 在Gene Cards数据库中检索得到968个疾病靶点；在TTD数据库中中检索得到10个疾病靶点；在OMIM数据库中检索得到654个疾病靶点；在Drug Bank数据库中检索得到41个疾病靶点；在DISGENET数据库中检索得到482个疾病靶点，五个数据库共获得靶点1565个疾病靶点，筛除重复靶点后最终获得1219个疾病靶点。运用venny 2.1.0在线绘制韦恩图，得到白芍-麦冬治疗SS的潜在作用靶点（见图1）。

2.3 中药有效成分-作用靶点互作网络构建 通过Cytoscape3.9.1软件构建“白芍-麦冬”药对的“有效成分-作用靶点”网络构建。然后使用工具Network Analyzer进行分析，根据等级值（Degree）设置节点大小和颜色深浅。该网络中共有94个节点，149条边（图1），其中红色表示白芍、麦冬两味药物、黄色表示麦冬的成分、绿色表示白芍的成分、蓝色表示基因（见图2）。等级排名前3的有效活性成分分别是：分别豆甾醇、没食子酸、β-谷甾醇（见表1）。

2.4 PPI网络的构建及核心靶点筛选 将“白芍-麦冬-SS”三者共同靶点基因导入STRING数据库中进行分析处理，然后将从 STRING数据库中获取的 csv文件导入Cytoscape3.9.1中进行分析，最终得到一个有62个节点，251条边的核心靶点图。根据Degree值进行分层排列得到最终的4个核心靶点。分别是：AKT1、IL1B、CAT、IGF1。图中靶点的Degree值越大，节点越大，颜色越深、各靶点间的连线越粗，越能表明这4个核心靶点可能成为治疗SS的关键靶点，见图3。

2.5 GO和KEGG通路富集分析 通过DAVID数据库，计算富集得到富集分析结果。通过微生信平台绘制GO和KEGG分析图（见图4、图5）。从GO分析图来看白芍-麦冬有效活性成分作用的靶点主要富集在分子功能（BP）的基因表达的负调控、RNA聚合酶II启动子的转录的负向调节、RNA聚合酶II启动子转录的正向调节、DNA诱导的转录等生物过程；在细胞组成（CC）方面，细胞外区域、细胞外秘体、细胞质、核质体占比较高；在分子功能（MF）方面，血红素结合、酶结合、铁离子结合、氧化还原酶的活性排在前列。从KEGG分析中图可以看出，“白芍-麦冬”药对治疗SS主要参与的信号通路包括代谢途径、神经活性配体-受体相互作用、MAPK信号通路、TNF信号通路、cAMP信号传导途径等。

2.6 分子对接验证 将PPI网络图中筛选出来的核心靶点取前3位AKT1、IL1B、CAT做为受体分别于与“白芍-麦冬有效成分-疾病靶点”图中Degree值排名前3的成分豆甾醇、没食子酸、β-谷甾醇进行分子对接，计算出受体与配体之间的结合能，对接结果见表2。根据对接结果运用Rstudio软件绘制热能图（见图6）。通常认为结合能越低，受体和配体之间的结合力越强、稳定性越高。根据对接结果用PymoL软件对其部分分子对接结果进行可视化处理（见图7）。

3 讨论

在中医典籍中尚未找到与 SS 相对应的确切病名，由于其病因病机复杂，临床表现多种多样，因此历代医家将其归入“燥证”、“虚劳”、“周痹”等范畴。“燥痹”是80年代路志正教授提出的一种病症，路老认为，其主要病机是阴血亏虚，津枯液干，故以益气养阴、润燥生津为主。刘健教授根据多年对SS患者临床症状的观察，认为该病以脾胃亏虚，气阴两虚为本，故治疗上以益气健脾，养阴生津为主。白芍味苦、酸，性微寒，归肝、脾经，具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳等作用。现代药理研究显示，白芍具有镇痛、抗炎、免疫调节等作用。麦冬 味甘、微苦，性微寒，归肺、胃、心经具有养阴润肺、益胃生津、清心除烦之功效。现代药理学研究，发现其具有抗炎、抗氧化、保护心血管系统以及免疫调节等作用。本次研究从网络药理学的角度探究白芍-麦冬药对治疗SS的作用机制。

从PPI网络图分析可知，“白芍-麦冬”药对的活性成分靶点与SS疾病靶点有67个共同靶位基因，主要包括AKT1、IL1B、CAT、IGF1、MPO、EDN1、NOS1等。

在Cytoscape数据库中运用软件中的CytoNCA插件筛选出4个关键基因，分别是AKT1、IL1B、CAT、IGF1，表示它们可能是“白芍-麦冬”药对治疗SS的关键靶点。AKT是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶一种，AKT1是其3个关系密切的家庭成员之一，主要参与调控细胞代谢、炎症反应、血管生成等生物过程。CAT（过氧化氢酶）是一种以铁卟啉为辅基的结合酶，具有抑制炎症反应、激活免疫途径、增强机体免疫力等生理功能。研究发现，CAT可以减弱NF-κB的活化程度，下调与免疫相关的细胞因子，进而减少炎性因子的表达，缓解炎性反应。IL-1β在SS患者中高表达，通过与膜受体结合后激活核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路，促进TNF-α、IL-1β以及IL-8等一系列促炎因子的表达，从而使炎性反应持续加重。IGF1是一种活性蛋白多肽物质，研究表明IGF1刺激促炎因子TNF-α、IL-6的產生，并通过MAPK信号通路增强人外周血单核细胞的促炎反应。从PPI网络图中可以看出这些靶点具有协同效应，并可通过抑制炎症递质水平、调节免疫等途径实现对 SS的治疗。

从KEGG通路富集分析图可知，“白芍-麦冬”药对可能通过MAPK信号通路、TNF信号通路、cAMP信号传导途径等参与RNA聚合酶Ⅱ启动子转录、炎症反应、免疫调节等作用治疗SS。MAPK信号通路通过调控TNF-α，IL-1β和IL-6等促炎因子的表达水平，从而调节抗感染机制的平衡，参与炎症反应。研究表明MAPK信号通路不仅在炎症反应中起作用，而且在 T细胞、B细胞、树突状细胞等免疫细胞中也起着调控作用。相关研究发现TNF-α在SS患者的血清及唇腺组织中表达显著增加，表明TNF-α参与了SS疾病发展过程。从“有效成分-靶点”网络图分析可知，“白芍-麦冬”药对中核心成分主要3种，分别豆甾醇、没食子酸、β-谷甾。麦冬中的豆甾醇不仅能有效抑制炎症因子IL-1β和TNF-α的水平，而且还能升高抗炎因子IL-10水平，发挥抗炎作用。没食子酸是一种天然多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒的作用。β-谷甾醇能抑制 LPS诱发的表皮细胞和巨噬细胞的炎症小体NLRP3，从而抑制 MAPK信号途径的激活，降低 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等炎症因子的分泌，从而达到抗炎的效果。67个靶点基因可能通过与MAPK信号通路、TNF信号通路、cAMP信号传导途径等信号通路作用在其核心靶点发挥抑制炎症反应、调节免疫等作用。

綜上所述，本文以网络药理学为基础，探讨了白芍-麦冬的有效成分、作用靶点、蛋白关系网络、KEGG通路的富集分析。表明白芍-麦冬治疗SS是多种成分通过多条通路作用于多个靶点的结果。分子对接的结果表明，核心成分与核心靶点结合良好。并由此推测“白芍-麦冬”药对可能通过豆甾醇、没食子酸、β-谷甾醇等有效活性成分调控AKT1、IL1B、CAT、IGF1、MPO、EDN1、NOS1等67个疾病靶点，影响炎症应答、免疫调节的负调控等相关生物学过程及MAPK信号通路、TNF信号通路、cAMP信号传导途径等从而发挥治疗SS的作用，为后续深入研究“白芍-麦冬”治疗SS提供了理论依据，为“白芍-麦冬”药物的研发提供新思路，但其结论有待于更有针对性的细胞实验、动物试验等方法来证实，以更好地阐明其临床机理。

参考文献：

［1］Vartoukian SR，Tilakaratne W M，Seoudl N，et al. Dysregulation of the suppressor of cytokine signalling 3-signal transducer and activator of transcription-3 pathway in the aetiopathogenesis of Sjögren’s syndrome［J］.Clin Exp Immunol，2014，177（3）：618-629.

［2］Yao W，Le Q.Social-economic analysis of patients with Sjögren’s syndrome dry eye in East China：across-sectional study［J］.BMC Ophthalmol，2018，18（1）：23.

［3］阿古达木，陈薇薇，夏嘉，等.苏晓从三焦辨治干燥综合征的经验［J］.上海中医药杂志，2021，55（5）：27-29.

［4］陈瑞莲，刘健，汪元，等.刘健教授中医药治疗干燥综合征用药规律的数据挖掘研究［J］.风湿病与关节炎，2021，10（6）：1-5+28.

［5］姜泉，张华东，陈祎，等.路志正治疗干燥综合征经验［J］.中医杂志，2016，57（6）：463-465

第一作者

罗鸿 中国清华大学生命学院生物专业创新领军工程博士研究生预科、中国国家药科大学生命科学与技术学院2023级硕士研究生、中国信息协会大数据分会大数据与生物项目特约顾问。

张颖    中国清华大学生命学院生物专业创新领军工程博士研究生预科、中国国家药科大学生命科学与技术学院2023级硕士研究生。