非因空间多组学基础篇 | 空间蛋白组学技术

继2020年《Nature Methods》的年度技术、2022年《Nature》的年度七大颠覆性技术之后，空间组学（Spatial Omics）再获殊荣，被《World Economic Forum》评选为2023年的十大新兴技术，同时相关研究综述也高调发表在多份期刊。

目前空间组学技术在空间转录组、空间蛋白组以及空间代谢组领域的研究中应用比较广泛。

首先，针对空间蛋白组学技术展开介绍~~

蛋白质是细胞功能的承担者，解析蛋白的时空特异性，是了解组织及疾病中微环境异质性、生命发生发展等特点的关键分子。

常规的蛋白质组学分析方法针对大块组织，然而在组织均质化过程中丧失了空间分布和细胞类型信息，最终得到的信息只能反映裂解液中蛋白表达的平均水平。空间蛋白质组学技术，可以精细获得空间范围内不同细胞和功能区域的蛋白表达谱。通过把空间中的细胞类型信息与蛋白质组数据联系起来，将深入了解组织空间微环境并发现更精准的生物标志物和新的功能机制。

根据定量方法的不同空间蛋白组学技术可以分为三大类：

一、基于荧光抗体的空间蛋白组学技术

CycIF：即Cell DIVE单细胞空间蛋白组学，是一种超多标多重免疫荧光成像技术，可以在单个组织切片上同时研究多达60个蛋白，通过特殊的荧光擦除技术、背景自荧光矫正，并结合从高内涵成像技术转化而来的高精度连续成像技术对组织样本进行高精度扫描，然后结合HALO人工智能图像识别，对样本区域进行组织分类、定量和密度距离计算等其它基于单细胞研究的分析（图1）。技术缺陷是多靶标成像周期较长，随着抗体孵育轮次的增加，抗原抗体结合的免疫亲和力降低甚至丧失，需要经过大量的组织优化实验来实现精准检测。目前Cell DIVE技术验证过的抗体已达上千种，研究人员可以灵活选择需要的抗体进行实验。

CODEX：其核心设计原理是通过每种抗体上标记特异性寡核苷酸“条形码标签”(Barcode), 而不是直接标记荧光染料。成像所需的荧光染料是通过和Barcode互补的寡核苷酸序列特异性结合，使得CODEX突破可见光谱荧光成像通道数量的限制，轻松实现50种或更多蛋白指标的同时检测及分析（图2）。最新商业化的PhenoCycler平台，每一轮可以对3种抗体进行荧光成像，一次可以检测到100种以上的靶标蛋白。

二、基于测序的空间蛋白组学技术

DSP-蛋白：该技术将实验与集成系统相结合，利用荧光标记选取兴趣点（Region of Interest, ROI）将需要分析的特定区域通过多色组合的组织形态学标记进行划分，通过微米级高精度UV光解技术将不同ROI上的核酸链解离下来，与捕获探针和荧光探针杂交，通过特有的nCounter分析系统进行计数定量，来实现对每个ROI中表达谱分析（图3）。DSP技术的另一独特优势在于样本形式广泛，包括FFPE、新鲜冰冻切片、TMA和细胞样本。此外，该技术灵敏度较高，仅60-100个细胞量即可产生可用于分析的数据，而且ROI圈选可与连续切片的HE或IHC染色相结合，对特定组织区域和结构的分析具有巨大的优势。当然，该技术也存在一定的局限性，ROI选择较为主观，虽然有针对性的方法提高了检测灵敏度和定量的稳健性，但它失去了发现新RNA靶标的潜力。对单细胞分析过程中细胞分型还需要依赖反卷积的算法来实现，但该技术在免疫肿瘤学领域的广泛应用具有前所未有的优势。

三、基于质谱的空间蛋白组学技术

IMS（质谱成像技术）：是一种非常灵敏的分子成像技术，传统的IMS技术基于基质辅助激光解吸电离质谱仪（MALDI-MS），其中微米级的激光束落在金属基板上制备的组织上。当激光激发点的电离分析物被诱导到质谱分析仪进行肽段识别时，可以通过光栅扫描同时生成组织图像，生成点位置和相关质谱之间的协调数据（图4）。虽然该技术可以在几十微米分辨率的基础上实现几十种到一百种蛋白或多肽片段的分析，然而该技术一般通过HE组织染色来指导需要解析的兴趣区域（ROIs），并受制于其分辨率，因此很难对特定的亚组织结构进行精确剖析。加之作为非偏倚的质谱蛋白组学技术，无法对特定区域中的特定兴趣靶点进行基于密度距离的精确定量分析，尤其在靶向药物与免疫药物结合的研究中，不能发挥强大的作用。

MIBI（多重离子束成像）：该技术在一定程度上弥补了IMS缺陷，将空间成像方法与质谱联用，可能有助于在组织精确成像方面达到另一个维度。它使用金属同位素元素作为报告标签来标记抗体，同时检测FFPE组织切片上的多达100个靶标（图5）。传统组织学染色可能包括在这个组合内，可实现虚拟组织图像与抗体表达数据的精确重建。然而，该技术检测靶标严格限制在100个，同时极高的硬件造价和同位素标记抗体、特殊的组织固定基质和可选择的同位素种类均限制了该技术的大规模应用。