Day2：Multi-dimensional single-cell characterization revealed suppressive immune microenvironment …

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title：Multi-dimensional single-cell characterization revealed suppressive immune microenvironment in AFP-positive hepatocellular carcinoma
author:Huisi He, Shuzhen Chen,ZhecaiFan, Yaping Dong,YingWang,ShiyaoLi,XiaojuanSun,YutingSong, Jinxian Yang,QiqiCao,JieJiang, Xianming Wang,WenWen and Hongyang Wang
time:2023 Jun 19
journal:cell discovery IF=33.5

Objective:

aim to identify the characteristic features and potential treatment targets of AFP-negative HCC (ANHC) and AFP-positive HCC(APHC).(已知Alpha-fetoprotein (AFP)-secreting 甲胎蛋白分泌与HCC的预后较差有关)

Results:

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Fig1A: 为了表征APHC和ANHC临床和病理特征，首先整理两个数据库数据（SEER database & Eastern Hepatobiliary Hospital (EHBH) database），图中展示的是SEER database的筛选结果，including 13,990 ANHC and 41,432 APHC。
Fig1B：无论是否进行手术或辅助治疗（部分图在附图），APHC 组的中位总生存期 (OS) 均远短于 ANHC 组（13 个月 vs 48 个月），表明 APHC 患者的预后明显较差。
Fig1C: 在 EHBH 队列中观察到类似的生存曲线。
Fig1D: 使用从匹配肿瘤（ANHC，n = 6；APHC，n = 6）和邻近正常组织（ANT）生成的全基因组测序（WGS）数据来分析 APHC 和 ANHC 的典型基因组改变。> 60% 的肿瘤显示 TP53 突变，并且 > 50% 的患者在编码 TITIN 的 TTN 中存在突变。（这部分作者说到了APHC的这两种突变含量更高，并没有给直接的统计结果，pvalue之类的）。同时，作者觉得ANHC 和 APHC 在全基因组水平上尚未得到很好的表征。（意思是没有显著差别？）
Fig1E：关于具体的实验设计
Fig1F: 单细胞聚类结果（92,762个细胞），比较整体的分了几个大类。
Fig1G&H: 细胞周期与组织来源的比例图，作者确定了所有三组中所有可用细胞的细胞周期状态，并且在 APHC 组中观察到处于 G2/M 状态的细胞比例比 ANHC 或 ANT 组中更大，这表明 APHC 中的细胞增殖更加活跃。（这里我觉得应该给出比例比较的pvalue更有说服力，不过可以学一下如何鉴定细胞周期，以此表征细胞增殖活跃度）

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Fig2A:inferCNV对所有的非免疫细胞做，然后降维，观察到大多数癌细胞簇中存在患者特异性聚集，而相邻非癌组织中的非恶性细胞聚集在一起。
Fig2B:差异基因的变种画图，通过对两个肿瘤细胞区室进行差异分析，我们发现许多与抗原呈递相关的基因在APHC中上调，而多种代谢酶（如CYP3A5、ALDOB）在ANHC中高表达。
Fig2C:GSVA显示，APHC 中干扰素-γ (IFN-γ) 反应以及抗原加工和呈递通路显著富集。
Fig2D:MHC I 类和 MHC II 类抗原呈递基因在 APHC 中高表达，尤其是 MHC II 类。(为什么挑选出MHC进行讨论)
Fig2E: IHC 和多重 IHC 验证了 APHC 患者样本肿瘤细胞中 HLA-DR 表达升高
Fig2F:做了关于转录因子的分析，APHC 包含众所周知的原癌基因 MYC 和重要的干扰素调节因子 IRF7 等调节因子。对于ANHC，作者发现RXRA, retinoic acid X receptor α, FOXA2, and Forkhead Box A2，所有这些都在新陈代谢中发挥着关键作用。

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Fig3A:对52,723 个 T/NK cell的降维分群。
Fig3B: 虽然邻近非肿瘤组织中 CD3-Effector 和 CD8-Cytotoothed 等抗肿瘤细胞的比例增加，但肿瘤组织中 Tregs 和 CD8-Exhausted 却富集。（并未给出pvalue）
Fig3C: 观察到 ICI 相关基因（PDCD1, CTLA4, HAVCR2, TIGIT , LAG3）表达水平的连续性，在 CD4+ 和 CD8+ T 细胞的四个亚群中，ANT 中平均表达较低，ANHC 中中等表达，APHC 中高表达。(趋势没有很明显，且无pvalue)
Fig3D: APHC的CD8+T细胞中表达LYAN、TNFRSF9等耗竭标记，CD4+T细胞中表达TIGIT，而ANHC的T细胞中IFNG、TNF等效应基因相对占优势（未显示出有差异，只是高表达低表达）。
Fig3E: CD8+PD-1+ T cells, Tregs, and CD4+CTLA4+ T 细胞在APHC中比例较高。
Fig3F: 随着APHC 中各种免疫检查点分子（即 CTLA-4 和 PD-1）表达增加CD4+ T 和 CD8+ T 细胞均表现出 T cell 功能障碍。
Fig3G: 对bulk RNA-seq数据（n = 44；ANHC，n = 12；APHC，n = 32）进行ssGSEA，结果显示APHC 在 T cell exhaustion和trafficking signature genes有更高的富集分数。
Fig3H: 来自APHC的 > 50% of CD8-Exhausted T cells 属于扩增克隆, 显示出更高的扩增（> 5 个克隆型）, 而来自ANHC 的主要克隆扩增是CD8-Cytotoxic and CD8-Effector cells。（APHN不也是这两个细胞类型吗？这里说的时候不是很牵强？）
Fig3i: 鉴于肿瘤突变负荷 (TMB)、新抗原产生和 T 细胞扩增呈正相关，作者对 24 个 HCC 进行了全基因组测序分析。APHC 显示出较高水平的 TMB，这可能有助于 T 细胞激活和扩增，特别是在耗尽的 T 细胞中。

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Fig4湿实验：这些数据为 AFP 在调节 T cell功能中的作用提供了证据，包括但不限于招募 T reg 和exhausted Cd8+ T cell，促进肿瘤细胞存活。

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Fig5A: 对myeloid lineagea 细胞进一步细分，comprising 2 clusters for monocytes, 5 for macrophages, and 4 for DCs
Fig5B: 作者对巨噬细胞做了细分，并认为 M1/M2 二分法对于捕获 TAM 表型的多样性来说是没有意义的
Fig5C: 分析巨噬细胞的表型并揭示 APHC 中增强的抗炎特征，这里的anti-inflammatory pro-inflammatory score咋算的？
Fig5DE：为了证实骨髓细胞亚群之间的广泛可塑性和潜在的细胞命运转换，采用单细胞调控网络推理和聚类（SCENIC）和RNA速度方法，识别了涉及的TF
Fig5F: 作者展示了不同病人之间细胞类型占比的变化，单核细胞主要在normal组织中
Fig5G：根据前面的分析，锁定TAM-SPP1+，在tcga数据看生存，有差异。
Fig5HI：通过multi-color IHC 进一步证实了 TAM-SPP1+ 在 APHC 和 ANHC 中的分布
Fig5J: TAM-SPP1+ 表现出低phagocytosis score, reduced ability to regulate lymphocyte migration, 和高的angiogenesis score。（这些评分怎么算的？）
Fig5K：细胞系上敲除SPP1, 细胞更容易往 M1-state极化，并且显示出吞噬大肠杆菌的能力增强

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Fig6A: 作者使用 CellPhoneDB 分析TAM-SPP1+与其他细胞类型的关系，探索可能相互作用的配体和受体。发现SPP1 是排名第一的配体，它可以结合整合素（integrins）、前列腺素 E2 受体 4 (EP4)、趋化因子（C-C 基序）受体 8 (CCR8) 和 CD44。
Fig6B-E： 湿实验证明敲除SPP1，肿瘤中抑制性 T 细胞和 TAM 的比例相对较高
Fig6F-H：湿实验证明不同 Spp1 水平的 BMDM 的 T 细胞转化和功能的改变。
Fig6IJ：联合治疗在抑制肿瘤生长方面表现出协同作用

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Fig7A-C: 通过配体-受体分析表明基质细胞和 TAM-SPP1+ 之间存在丰富的细胞间通讯，基质细胞信号转导TAM-SPP1，可诱导 SPP1 表达，并主要由 TGF-β1、IL6 和 FGF1 介导，通过整合CellPhoneDB的结果，作者最终确定了两个候选分子，TGF-β1和IL6，它们可以诱导巨噬细胞中SPP1的表达
Fig7D:体外研究表明，IL6和TGF-β1均可在分化的THP-1中以时间依赖性方式上调TAM-SPP1+
Fig7E: SPP1 的诱导被 TGF-β1/SMAD 抑制剂 SB431542 和 IL6/STAT3 抑制剂 Ruxolitinib 消除
Fig7F: THP-1维持一定水平的TGF-β1和IL6分泌，任一途径的激活均可上调TAM-SPP1+的比例
Fig7G: APHC 显示出比 ANHC 显着更高的 TGF-β1 和 IL6 水平，这可能有助于增强 TAM-SPP1+ 的积累以及随后耗尽的抗肿瘤免疫状态。

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Fig8: Summary of immune features and dynamics in ANHC and APHC

Summary：

先根据AFP分类HCC人群，并在两个cohort中发现预后上有差异。所以引出APHC为什么更严重。主体是单细胞数据，包含WGS，bulk RNA-seq等数据。 先利用单细胞数据进行非免疫细胞的比较（差异基因，通路富集）。再看T cell上的差异，发现Tcell的免疫功能损伤（比例，功能，免疫基因，克隆扩增）。湿实验证明AFP蛋白怎么影响的T cell。随后转到myeloid cell，发现TAM 的一个特定子集 TAM-SPP1+ 在 APHC 中富集，表现出吞噬作用减弱，但血管生成能力和淋巴细胞迁移能力增强。串联myeloid cell 和T cell,提出假设TAM-SPP1+ 还可以通过抑制 CD8+ T 细胞激活来促进肿瘤细胞逃避，湿实验设计证明SPP1对T cell的影响。为了进一步阐明TAM-SPP1+的起源，作者又关注了stromal cells (i.e., endothelial cells (ECs), fibroblasts),并找到了上游两个分子TGF-β1和IL6， 介导spp1的表达。
最终故事：
内皮细胞释放的TGF-β1和IL6诱导SPP1升高，APHC组TAM-SPP1+的细胞比例高，而SPP1是CD44的配体，促进肿瘤细胞，抑制T cell。

Data:

WGS sequencing, bulk RNA sequencing，single-cell RNA sequencing (6 ANHC, 6 APHC, and 4 adjacent normal tissues).
cytometry time-of-flight on 30 HCCs.
multiplex immunohistochemistry on additional 59 HCCs.
data available:The raw scRNA-seq data reported in this study have been deposited in the Genome Sequence Archive in the National Genomics Data Center, China National Center for Bioinformation/Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences, and are publicly accessible at https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa (Bioproject accession number: PRJCA016727; GSA-Human: HRA004584).

Sth to learn:

鉴定细胞分期的状态，来表征细胞增殖活跃度
inferCNV
TF activaty ：pySCENIC
如何计算的regulon score /ranks。
T Cell Clonal Analysis Using Single-cell RNA Sequencing and Reference Maps
如何计算phagocytosis score, reduced ability to regulate lymphocyte migration, angiogenesis score
如何计算anti-inflammatory pro-inflammatory score

record some words for writing

a more aggressive progression and worse prognosis
a hierarchical regulatory network works together to shape a more immunogenic and malignant feature in APHC tumor cells.
The distinct clusters were determined by their specific gene expressions and known lineage markers（如何确定的细胞类型）

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