慢病毒包装步骤与常见问题

慢病毒包装步骤

第1天：我们常规使用的第三代慢病毒包装系统包括1个转移质粒（Transfer plasmid）、1个膜蛋白表达质粒（Envelope plasmid）、2个包装质粒（Packaging plasmids），将这些质粒共转染包装细胞。2个包装质粒分别为Gag/Pol表达质粒和Rev表达质粒。

第3天：在细胞里，转移质粒转录出携带目的基因（Gene of Interest，简称GOI）的HIV RNA基因组，与包装质粒表达出的衣壳结构蛋白、酶、调控蛋白组装成病毒颗粒后，转运到细胞膜内侧，形成包膜病毒分泌到胞外。膜蛋白质粒表达的VSV-G膜蛋白锚定在细胞膜上，随着病毒成熟，与细胞膜一起成为了病毒的膜。细胞短暂孵育后，收集上清，离心去除细胞碎片并过滤。

第4天：PEG浓缩病毒颗粒。对于超纯化慢病毒（体内应用级别），采用蔗糖离心方法进一步纯化、浓缩病毒。

第5天及以后：对病毒进行滴度测定（Titer determination）、微生物检测（Bioburden test，针对细菌、真菌）、支原体检测（Mycoplasma test）等。

若转移载体同时编码一个荧光蛋白，我们还会将病毒进行细胞转导以测定相应的荧光表达情况（Transduction test）。此外，对于超纯化慢病毒，我们还可以检测内毒素水平（Endotoxin test）。

慢病毒操作中的常见问题

Q1. 用于慢病毒感染的细胞接种量多少才合适呢？

A. 以在感染 3 天左右长满培养皿底部为宜，不同细胞根据其生长速度灵活调整接种量

Q2. 慢病毒感染后细胞状态异常？

A. 出现这种情况时，有几个主要原因：

(1）首先，确定是否有支原体或者细菌污染

(2）可能是 MOI（感染复数）过高，需要摸索寻找最适合的 MOI

(3）同时考虑目的细胞可能比较敏感，更换其它细胞感染确定病毒是否有问题

(4）如果以上都排除后细胞状态仍然不好，尝试增加血清含量，观察细胞状态是否好转

Q3. 慢病毒感染效率低怎么办，如何提高慢病毒感染效率？

A. 慢毒感染效率低，主要需要考虑的问题有：

(1）细胞是否适合用慢病毒进行感染？（慢病毒适用于大部分细胞系，例如肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞等，但也有一些细胞不适合用慢病毒感染，可能更适合用腺病毒，可查阅文献，或咨询我们）

(2）慢病毒是否进行了正确的存储和稀释？如果病毒存储不当或反复冻融会降低病毒活性，从而导致感染效率降低

(3）感染操作问题：首先排查 MOI 是否合适；其次可以使用海星生物推荐的 1/2 体积感染法来增加感染效率；最后感染换液（一般 24 h）及观察的时间是否合适

(4）对于一些难感染细胞的感染方法：例如悬浮细胞可使用平角离心转染法，其他一些较难感染的细胞可进行二次感染

(5）可以添加助转染试剂 polybrene 增加感染效率

Q4. 慢病毒感染细胞荧光表达较弱？

A. 荧光蛋白的亮度与启动子、表达方式和连接原件等有关：

(1）不同启动子诱导荧光蛋白表达的强弱不同，如 UBC 相对于 EF1α、CAG、CMV 等强启动子表达较弱

(2）融合或非融合表达与荧光强度也有很大关系，融合表达时荧光蛋白可能出现错误折叠等现象，导致检测不到荧光信号或荧光较弱；非融合表达时一般选择连接肽作为连接原件，如 2A 肽或 IRES 将 ORF 分隔开

(3）带荧光的慢病毒感染细胞后，荧光的强度取决于病毒进入到细胞的颗粒数、细胞状态、细胞类型、观察时间等因素，荧光表达的强度与目的细胞感染病毒的颗粒数正相关，一般感染细胞后72h 观察荧光强度最佳，而增殖较慢的细胞可以适当延长时间

(4）也可能会遇到过表达的慢病毒比对照的荧光要暗的情况，这主要是因为基因的插入，会影响位于下游的荧光蛋白表达

Q5. 在筛选稳定细胞株时，为什么细胞荧光正常，药物筛选后大量荧光阳性细胞死亡？

A. 出现这种情况时，有几个主要的原因：

(1）抗性基因由弱启动子启动表达较弱

(2）抗性基因表达在 IRES 之后

(3）使用药物剂量过高

Q6. 为什么慢病毒稳定株会出现表达或者干扰效果丢失？

A. 慢病毒是 RNA 病毒，感染细胞后会整合进细胞基因组，因此理论上该基因一直都会表达。但并不意味着稳定株一直传代是一个好的选择；
因为一方面，细胞传代次数增加可能使得该细胞干扰或者过表达的基因受到代偿机制的调节，导致多次传代后干扰和过表达效果下降，另外一方面，细胞本身随着传代增加其理化性质会逐渐变化，比如原代细胞随着传代次数增加细胞逐渐老化，基因表达谱变化本身就会很明显，又比如永生化细胞或者肿瘤细胞随着传代次数增加其积累突变也是增加的，这也会导致其表达谱变化。因此建议，稳定株构建好之后可以多冻存代数较早的细胞，每次实验尽量使用代数靠前的细胞。