下一代病理技术—mIHC

不知道各位看官有木有发现，最近高分文章都开始频繁使用一个技术，那就是mIHC。小编去PubMed数据库中检索了一下，嚯，相关文章还真不少呢，且文献数量逐年飙升。

图1（截至2023年6月）

根据期刊影响因子将文献分为四个水平：“≥20”、“10～20”、“5~10”和“<5”，绘制五年内不同水平期刊的数目和文献数量折线图（图2），可发现中、高等水平期刊（“5～10”、“>20”）逐年增加，尤其是中等水平期刊刊载的文章，5年增长了将近4倍呀！

图2（截至2023年6月）

那这到底是何方神圣呢？

多重荧光免疫组化技术 (Multiplex Immunohistochemical，mIHC)  是为了解决传统技术在研究肿瘤免疫微环境中的弊端而生的一项技术，它作为近几年全球热点技术，在肿瘤治疗、神经科学、干细胞研究、器官移植等多个领域都有重要的研究成果报道，为多种疾病精准诊疗指明了新方向。

随着肿瘤免疫微环境研究成为肿瘤精准诊疗基础，既往的病理诊断技术均暴露出一定的局限性，无法适应下一代诊断病理学的需求。例如，免疫荧光 (Immunofluorescence，IF) 仅能标记2-3个指标，难以准确刻画复杂的肿瘤微环境的真实特征；免疫组化 (Immunohistochemistry，IHC) 可通过连续切片进行多指标标记，但无法准确分析各个蛋白、细胞间的相关性，只能进行定性判读且存在人为主观性；流式细胞术和基因检测可以获得大量细胞和基因层面的信息，但缺失了所得信息的原位空间位置关系。

mIHC可以在细胞或组织样本原位上检测多个目标靶点，通过这些靶点的组合和位置关系的研究，进而阐明其相互作用机理。该项技术不仅可大幅提高被检测信号的灵敏度，同时也可解决了在同一张切片上进行多种同种属生物标志物检测的难题，通过定量病理分析可获得组织细胞原位各种靶标类别、组分、表达量等信息，各靶标及其相互作用的空间定位、定性和定量等信息，全面、系统、直观、科学地解析这些信息对于研究疾病的发生发展机制，对于探讨疾病诊断和治疗疾病的有效方法有着重要意义。

如何实现以上优势？

根据mIHC所使用的技术原理，如图3所示，可以将其分为 (A) 基于显色染料技术、 (B) 基于金属同位素技术、 (C) 基于荧光技术和 (D) 基于DNA barcode技术等四大技术平台[1]。

图3

A、基于显色染料的mIHC

典型的代表是罗氏的DISCOVERY ULTRA，原理是经典的IHC的一抗捕获+二抗显色的结构，显色底物是类似DAB的显色染料，不过由于它们有较广的光吸收谱，会形成一种在光学显微镜下容易区分的深色染色图，如下图4所示。DISCOVERY ULTRA技术不需要另行购置配套的光学显微镜，使用常规光学显微镜即可进行原位表达分析，检测多重共定位靶标。但是它没有配套的分析软件进行定性或定量分析，多靶标的共定位结果分析有一定的难度。它的靶标检测通量相对较低，最多可以同时检测5个靶点。

图4

B、基于金属同位素的mIHC

基于金属同位素技术的mIHC有两个代表性的平台，一个是成像质谱流式技术（Imaging Mass Cytometry，IMC），它依靠高分辨率的激光烧蚀技术和质谱流式技术的结合，理论上最高检测指标可达100个，根据目前可以用的同位素类型，实践中可以同时检测超过40 个靶标。IMC平台的缺点在于图形获取速度非常慢，它是通过免疫荧光的显色图来选择特定区域进行分析的，如下图5所示为IMC的人组织显色图，对于一个1000um2的组织区域，需要耗时2h来完成数据获取 ，另外由于它是单抗体显色的平台，缺少二抗及后续的级联反应效应，它的灵敏度要比 IF 低，而且激光光斑的精度所限，它的分辨率设定为1um，比其他mIHC技术都要低。

图5

另一个技术平台是多重离子束成像技术 (Multiplexed Ion Beam Imaging，MIBI) ，检测靶标数可达40-100个。它有一个配套的成像和分析软件平台 MIBItracker Software ，可以在多个分辨率下进行重扫描，获得亚细胞定位信息，它不仅可以获取免疫细胞浸润、细胞形态和空间定位，同时也可以获得蛋白的定量表达结果。但是空间位阻和非特异性吸附依然是它的一个挑战，合适的染色和成像也有一定的难度，还有一个缺点是它的成本非常高。

图6[2]

C、基于荧光成像的mIHC

Vectra是一个基于免疫荧光的多重IHC/IF检测技术，通过多次染色循环，可以实现同时检测9个靶标（如图7所示）。每一次染色循环后，需要洗去上一循环留下的染色标记，因此彻底清除多重染色循环间的检测残留是Vectra的一个挑战。这个技术是过去5年中最为广泛采用的mIHC技术之一，已经有医院和研究机构采用它作为临床检测平台以帮助临床医生进行临床诊断。现在已经有了很多自动化的染色设备如Leica Bond Max，一天可以完成30张七色病理切片的染色。

图7

D、 基于DNA barcode的mIHC

基于DNA Barcode的技术主要包括两种，一种是DSP空间多组学技术平台，它的实现原理是依靠一个特殊设计的连接了DNA barcode的抗体，检测抗体与DNA barcode间通过一个紫外光解的连接子连接，可以在紫外光的照射下释放DNA barcode，对DNA barcode进一步的测定即可实现靶标的定量检测，同样的由于使用DNA barcode进行靶标的区分，突破了荧光图像的可用通道数的限制。通过选择合适的区域进行测定，可以实现空间蛋白组学的多重靶点的定量检测。DSP并不局限于蛋白靶点检测，也可以进行RNA靶标的检测，使用经过特殊设计的探针进行靶标吸附，相比传统的RNA-seq，DSP除了有空间定位信息外，还可以检测到低丰度基因表达数据。

图8

另外一个CO detection by indEXing (CODEX)技术也是依赖于多重染色技术实现多重靶标检测，其核心设计原理是每种抗体上标记特异性寡核苷酸“条码标签”(Barcode)，成像所需的荧光染料是通过和Barcode互补序列特异性结合，使得该技术突破可见光谱荧光成像通道数量的限制。

图9[3]

什么样的文章选题适合用mIHC技术呢？

mIHC的应用的场景是非常的广泛的，比如：组织微环境特征分析及生物标记物发现；临床试验病人入组分析；生物标志物定量检测及药效预测和预后评估；分析疾病微环境中各种类型细胞间的空间分布关系；复杂细胞表型、功能状态的判别；分子分型；TILs（肿瘤浸润淋巴细胞）分析、肿瘤浸润边界特征分析；用于推演信号通路上、下游分子协同表达的关系等。下面是几个应用实例：

应用实例一：肿瘤免疫浸润

乳腺癌 (Breast Cancer,BC) 中肿瘤浸润淋巴细胞 (Tumor-infiltrating Lymphocytes,TILs)的数量是提高患者生存率的强有力的预后因素，尤其是在三阴性 (Triple-negative Breast Cancer,TNBC) 和 HER2 过表达的 BC 亚型中。尽管 T 细胞是 TILs 中主要的群，但 T 细胞亚群的数量和差异与患者预后之间的关系仍未可知。

Peter Savas[4]等人利用单细胞转录组测序 (scRNA-seq) 数据发现较多数量的 CD8+ T细胞与表达 CD103 的这些细胞之间存在显着相关性，并利用mIHC 可以获得各靶标及其相互作用的空间定位、定性和定量等信息的特点，在原发性 TNBC 中证实了同样表达 CD103 的 CD8+ T 细胞的存在（图10）。作者的研究揭示了 BC 中 CD8+T 细胞差异，并证实差异细胞中基因标志和 TNBC 的存活率提高之间存在显着关联，为进一步了解 T 细胞亚群的发育、维持和调节奠定了基础。

图10

应用实例二：肿瘤微环境研究

Halse, H[5]等人运用 mIHC 对转移性黑色素瘤中的免疫亚群进行精准定位，数据量化了肿瘤内 (Intra-tumor, IT) 与肿瘤基质 (Peri-tumoral, stroma) 的免疫亚群数量，以及免疫亚群与 (Tumor margin, TM) 的距离。如图11所示，使用 mIHC 在特定肿瘤区域分析转移性黑色素瘤中免疫亚群的精确位置，观察不同免疫亚群在瘤内的表达情况。结果显示，对于黑色素瘤的 MelTIL026 (盆腔淋巴结) 切片，大多数 T 细胞为 CD4+T 细胞，且在肿瘤边缘 (TM) 和间质区域 (S) 突出，在肿瘤内 (IT) 区域CD4+和CD8+ T细胞数量较少。

图11

应用实例三：肿瘤免疫治疗分析

癌症免疫疗法为应答患者提供了生存益处，但许多患者未能应答。识别治疗反应和耐药性的生物学特性是优化药物选择和改善患者结果的首要任务。Tuba N Gide[6]等人对158个黑色素瘤患者的肿瘤活检进行了转录组和免疫分析，这些患者接受了抗PD-1单药治疗（n = 63）或抗PD-1和抗CTLA-4联合治疗（n = 57）。并使用mIHC量化黑色素瘤活检中的T细胞和已知预测标记物（PD-L1）的密度和空间位置（图12），结果显示对单一疗法和联合免疫疗法有反应的患者在治疗前和治疗期间有较高的免疫细胞浸润，与之前的研究和数据一致。

这些免疫细胞群的量化确定了应答者在两种治疗中激活的T细胞特征和T细胞群，可用于预测患者对当前基于反PD-1的治疗方法的反应，为癌症患者的治疗选择和未来治疗策略提供了重要信息。

图12

mIHC技术作为当今肿瘤课题领域的最新技术，可从三个维度（定性、定量、定位）定义和刻画肿瘤微环境，其优秀的数据整合能力及广泛的应用场景更能为您的文章增光添彩！

参考文献

[1] Tan, Wei Chang Colin et al. “Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.” Cancer communications (London, England) vol. 40,4 (2020): 135-153. doi:10.1002/cac2.12023 IF: 16.2 Q1 B1

[2] Keren, Leeat et al. “MIBI-TOF: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structure.” Science advances vol. 5,10 eaax5851. 9 Oct. 2019, doi:10.1126/sciadv.aax5851 IF: 13.6 Q1 B1

[3] Black, Sarah et al. “CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies.” Nature protocols vol. 16,8 (2021): 3802-3835. doi:10.1038/s41596-021-00556-8 IF: 14.8 Q1 B1

[4]Savas, Peter et al. “Single-cell profiling of breast cancer T cells reveals a tissue-resident memory subset associated with improved prognosis.” Nature medicine vol. 24,7 (2018): 986-993. doi:10.1038/s41591-018-0078-7 IF: 82.9 Q1 B1

[5] Halse, H et al. “Multiplex immunohistochemistry accurately defines the immune context of metastatic melanoma.” Scientific reports vol. 8,1 11158. 24 Jul. 2018, doi:10.1038/s41598-018-28944-3 IF: 4.6 Q2 B2

[6] Gide, Tuba N et al. “Distinct Immune Cell Populations Define Response to Anti-PD-1 Monotherapy and Anti-PD-1/Anti-CTLA-4 Combined Therapy.” Cancer cell vol. 35,2 (2019): 238-255.e6. doi:10.1016/j.ccell.2019.01.003 IF: 50.3 Q1 B1