1. 亚细胞定位

细胞内含有多种细胞器，如细胞核、线粒体、高尔基体、内质网、叶绿体、细胞膜、细胞质等，这些都可以被称为“亚细胞”。蛋白通常分布在细胞内不同位置，实现机体不同功能。因此观察其在细胞内的分布情况，是一种常见分子生物学手段，从而为研究基因的作用机制提供方向。

2. 亚细胞定位实验原理

通过基因工程手段，构建重组融合蛋白，将蛋白质构建到荧光蛋白的N端或C端。通过转化技术或稳定遗传表达技术（常见的即农杆菌侵染），在受体材料中进行表达融合蛋白，荧光蛋白会受目的蛋白的牵引至相应的细胞器，在激光共聚焦显微镜下进行观察，可获得蛋白在细胞内的定位。

3. 实验流程

3.1 生物信息学分析

#序列比对
https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw
https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
http://bar.utoronto.ca/(特异性表达)
# 信号肽预测
https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-6.0
https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/
# 跨膜预测
https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0
# 亚细胞定位预测
https://ipsort.hgc.jp/
https://wolfpsort.hgc.jp/
http://cello.life.nctu.edu.tw/

3.2 实验试剂及配方

（1）500 mM MES (pH 5.6)：称取9.75g无水MES，用去离子水溶解，经NaOH调pH至5.6，定容至100mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，于4°C保存。
（2）100 mM 乙酰丁香酮：称取0.196g乙酰丁香酮，用5mL DMSO (二甲基亚砜) 溶解，再用去离子水定容至 10mL，0.22μm过滤器过滤除菌后，分装1mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。
（3）50 mg/mL Kana (母液)：称取1 g的Kana粉末，用去离子水溶解并定容至20 mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1mL至1.5mL的EP管中，于-20 °C 保存。
（4）100 mg/mL Amp (母液)：称取2 g的Amp粉末，用去离子水溶解并定容至20mL，0.22 μm过滤器过滤除菌后，分装1mL至1.5 mL的EP管中，于-20 °C 保存。
（5）25 mg/mL Rif (母液)：称取0.5 g的利福平粉末，用DMSO溶解并定容至20mL，不需要过滤除菌，直接分装1 mL至1.5mL的EP管中，于-20 °C 保存。
（6）100 mM MgCl2：称取1.0165 g的氯化镁六水（BBI: A610328），用去离子水溶解并定容至50 mL，于4 °C保存。
100mL浸染液：2mL的500 mM MES + 0.15mL 的100 mM AS + 10 mL 100 mM MgCl2，用去离子水溶解定容至100mL即可。
（7）1 L的LB 培养基：5g酵母提取物 + 10g胰蛋白胨 + 10g NaCl，相应的抗生素工作浓度为50 mg/L Kana、100 mg/L Amp和25 mg/L Rif (母液)。

3.3 实验步骤

1. 种植烟草：在14h光照/10h黑暗，温度25°C，相对湿度 70%条件下培养大概4～5周。
   2.转化农杆菌：将构建好的表达质粒转化至农杆菌中（注：GV3101、EHA105、LBA4404 这三种农杆菌均有报道可以用于烟草瞬时转化，在培养农杆菌时候除了添加载体所含有的抗生素外，不同农杆菌还需要添加其它种类抗生素，比如 GV3101 和EHA105还需要添加 50 μg/ml 的利福平）。
2. 小摇菌种：挑取转化有表达质粒的农杆菌克隆（EHA105）于1 mL含有相应抗生素的LB液体培养基中，28℃摇床200rpm培养24 h。
3. 大摇菌种：转移1mL培养的农杆菌菌液至20mL含有相应抗生素的LB培养基中，该LB培养基含15μM乙酰丁香酮（20 mL的LB中加入3 μL的100 mM AS）。在28 °C，200 rpm的条件下培养至农杆菌生长的对数期(OD600 = 0.5-0.6)。
   5.处理菌种：以室温，5,000rpm条件离心10 min以收集菌体，用浸染液 (含10 mM MgCl2, 10 mM MES，150 μM乙酰丁香酮，pH = 5.6)悬浮农杆菌菌体至OD600 = 1.0。室温静止2～3 h (至少 0.5 h，至多不超过3 h)。
4. 等体积混合两种含有不同质粒的菌体，用1 mL的针头在烟草叶片背面轻轻点开一个小口 (注意不要刺穿)，再用去掉针头的针管吸取菌液，从叶片伤口处注射到叶片中（如图1-2：以手指抵住叶片正面，将菌液从叶片的背面渗透进去）。用记号笔标记烟草叶片水渍状区域。
   7.注射过的植株于黑暗下放置12h，然后于21°C左右培养至2d后观察烟草注射农杆菌的区域有无荧光，撕取烟草叶片标记区域 (可以不撕，直接用刀挖出靠近伤口的叶片部分即可) 用激光共聚焦显微镜进行荧光的成像 (叶片背面表皮细胞层较好观察)。

3.4注意事项

1.选择健康、处于壮年的烟草叶片进行注射，幼嫩或皱缩叶片不易注射，衰老叶片的表达效率较低。叶片气孔打开的时候比较容易注射，因此最好在白天注射。
2.农杆菌菌液浓度是需要自己摸索的一个参数，OD600 = 1.0并不一定适用于所有的基因，高浓度可能导致叶片死亡，或者影响定位结果，建议设置不同浓度梯度进行比较，在可以获得荧光信号的前提下尽量采用低浓度的菌液。

3. 不同外源基因的瞬时表达效率大不相同，这一点在单转做亚细胞定位的时候表现得特别明显，效率高者基本每次都能达到100%发光，低者可能转10次只能表达出一两次，建议在BiFC之前先做个亚细胞定位评价一下两个基因的表达效率，以便调整两个质粒的转化条件。
   4.注射后的植株通常在2d之后观察，但不同基因表达的时间可能在1-7天不等。
   5.转化效率低：需注意农杆菌的活性，建议侵染烟草叶片的农杆菌OD600值为0.6；
   6.受体材料时期选择：拟南芥移栽之后3-4周可以做原生质体、生长4-5周的烟草苗比较适合注射（尽量选择顶部，不要移栽）。