Hacat人永生化角质细胞培养攻略

Hacat细胞来源于一位62岁患有黑色素瘤男性的病灶外围正常皮肤，是在体外培养后自然转化的永生化的人角质细胞，也是第一株永生化的表皮细胞。Hacat细胞角蛋白、角化细胞交联外膜蛋白、中间丝相关蛋自阳性，可用于人表皮细胞角化的研究。

细胞名称：人永生化角质细胞(STR鉴定正确)

细胞简称：Hacat

产品货号：TCH-C388

细胞形态：上皮细胞样

生长特性：贴壁生长

培养体系：DMEM-H +10%FBS +1%P/S

冻存条件：60%基础培养基+30%FBS+10%DMSO，液氮储存

质量检测：细菌、真菌、支原体检测均为阴性

Hacat 细胞培养注意要点

1. 消化时间长

Hacat细胞贴壁较紧，传代时消化时间较长，可能需要5min或者更久，具体时间因胰酶浓度、效价、消化条件有所不同，第一次对该细胞进行消化时要摸索最佳时间。注意消化前一定要用PBS清洗细胞2-3次，铺板时一定要均匀，因为HaCat成片生长，铺板不匀会存在局部生长过密难以消化，生长稀疏部分容易消化过度的情况。

2. 不可过度生长

如果Hacat细胞长满后没有及时传代，任其过度生长，可能造成不可逆转的损伤，导致传代后细胞碎片增多，细胞变形，不生长等情况。

3. 黑点较多

Hacat细胞的胞体内黑色颗粒较多，这是该细胞的特性。同时细胞外也有少量黑点，这些黑点是细胞碎片粘附在瓶底，当碎片较多时可在换液前用复温的PBS轻轻润洗。

4. 培养时存在漂浮细胞

少量漂浮细胞不影响细胞生长,漂浮细胞较多时可以通过换液清除。

5. 生长较慢

注意控制传代密度不要过低，建议细胞密度到达80%时进行传代。

Hacat 细胞传代培养

1. 预热完全培养基、胰酶和PBS；

2. 用PBS洗涤细胞2次。洗涤过程中注意动作轻柔。

3.加入胰酶，迅速铺匀，确保其充分接触细胞表面。

4. 显微镜下观察消化情况，约70%~80%细胞收缩变圆后，轻拍培养容器外壁，使 细胞脱离培养容器底面。立即加入胰酶双倍体积的完全培养基，轻摇培养容器，使培养基和胰酶迅速混匀，终止消化。

5.吸取细胞悬液，吹打培养容器底面数次，尽可能将细胞都吹打下来，将细胞悬液转移至离心管中。

6. PBS洗涤培养容器1~2次，收集所有细胞悬液至离心管中。

7. 收集的所有细胞悬液250 g离心4 min。

8. 离心后去除上清。加入2 mL预热的完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。

9. 将细胞按(2.5~4.0) ×10^4个活细胞/c㎡接种至适宜的培养容器内。

10. “十字法”摇匀细胞，将培养容器放入细胞培养箱中。

Hacat 细胞冻存

1. 待细胞生长至可传代的密度，即可准备冻存。

2. 消化细胞，取少量细胞悬液计数。细胞悬液经250 g离心4 min。

3. 离心后去除上清，用适量4℃预冷的冻存液重悬细胞。将细胞按比例或数量分装至冻存管中。一般冻存密度为(1.0~2.0)×10^6个/mL。

注意：细胞长时间在非培养条件下放置会严重影响细胞的状态。如离心后用冻存液重悬计数，请将细胞放置于4℃冰箱内，以减弱细胞代谢，较好的保持细胞状态。

4. 如使用海星一步冻存液，冻存管直接竖直放入-80℃冰箱即可完成“一步”冻存。如使用程序冻存液，需将冻存管放入提前预冷的程序降温盒后放入-80℃冰箱。

5. 24小时后可将冻存管转移到液氮进行长期保存。

注意：细胞不可长期保存在-80℃冰箱中。建议24 h后尽快转移至液氮中。