研究专题 │ 基于新兴生物标志物cfRNA的前沿应用与案例

研究背景

细胞外游离RNA（cell-free RNA，cfRNA)是存在体液中细胞外的RNA片段，由各种组织通过细胞代谢与凋亡，释放到循环血并游离在体液中。cfRNA包含多种RNA分子，如一些长链RNA（mRNA、lncRNA、circRNA）和短链RNA（miRNA、piRNA、tsRNA、rsRNA）。cfRNA的检测结果可以反映全身不同组织中基因表达、细胞间信号传导和细胞死亡程度的组织特异性变化。

图1. cfRNA反映了所有身体系统的分子变化（图来自illumina）

基于cfRNA的研究主要涉及生殖和肿瘤两大领域。在生殖方面，主要是基于体液进行胎儿基因检测和妊娠疾病早期诊断，可进行无创或微创的产前诊断。在肿瘤或癌症方面，主要应用于早期癌症诊断和肿瘤监测，科学家们已通过多项肿瘤或癌症研究，证实了cfRNA作为生物标志物在临床应用中的潜力。此外，cfRNA在神经退行性疾病（如阿尔茨海默症）、传染病（如结核病）、慢性病（如非酒精性脂肪性肝病）等疾病的预测、诊断、预后等方面也发挥了作用。

关键词:

细胞外游离RNA（cfRNA）；液体活检（liquid biopsy）；生物标志物（biomarkers）

研究案例

 1. 孕妇血液cfRNA液体活检预测孕早期先兆子痫[1]

2022年2月9日，美国斯坦福大学Stephen R. Quake团队在《Nature》上发表题为“Early prediction of preeclampsia in pregnancy with cell-free RNA”的研究文章。该研究通过多份孕妇血液样本鉴定并验证于先兆子痫的cfRNA转录组变化，研究发现在妊娠早期，cfRNA基因表达的变化可以明显区分正常血压和先兆子痫孕妇，通过这些变化可以建立液体活检，有助于在症状出现之前识别有先兆子痫风险的孕妇。

图2. c)匹配的妊娠年龄与先兆子痫发病时间;d)先兆子痫与分娩时的胎龄有关

图3. 妊娠早期，基因表达的变化富集于神经肌肉、内皮和免疫细胞类型和组织

通过分析（图2），研究团队识别并独立验证了一个由18个基因的集合，这些基因在妊娠5~16周时的测量可以形成液体活检的基础，能够在出现临床症状数月前就识别出先兆子痫风险的孕妇。研究团队基于发现组做了一个逻辑回归模型，经过训练、还有验证组验证，最终的模型表现良好，AUROC（受试者工作特征曲线下面积）、特异性和灵敏度一致。最后作者还探讨了以非侵入性方式监测器官健康的可能性，先兆子痫组与血压正常组的组织和细胞类型特异性变化符合研究队列中特异性的诊断。

综上，该研究展示了利用cfRNA进行液体活检在预测先兆子痫方面的潜力，对改善孕产妇健康具有重大意义。

2. 孕妇cfRNA图谱检测妊娠全程健康[2]

2022年1月5日，美国哈佛医学院附属医院布列根和妇女医院Thomas F McElrath联合美国Mirvie公司Michal A. Elovitz等研究者在《Nature》发表题为“RNA profiles reveal signatures of future health and disease in pregnancy”的研究文章。该研究采集分析了大量不同种族、年龄等背景的孕妇cfRNA样本，研究结果展示了cfRNA可揭示妊娠期全程在胎盘、母体和胎儿水平上基因表达变化的cfRNA图谱，从而预测患先兆子痫的风险，并包含与其病理生理相关的基因特征。

图4. 血浆样本，A~H共8个队列

该研究团队基于机械学习算法构建预测模型，将1908份cfRNA图谱进行建模和学习，随后在474例测试集中进行验证，结果显示该算法可预测胎龄至14.7天内，准确性与妊娠中期的超声检查相媲美，但优于晚期超声检查。

胎龄的cfRNA特征证明了妊娠进展中转录组的动态变化。作者联合分析了GO和MSigDB数据库的基因数据，定义了孕妇血浆中反映母体组织、胎儿器官和胎盘的cfRNA转录组的特定亚群。表明液体活检cfRNA图谱可实现监测妊娠期间母体、胎盘、胎儿的分子变化。

该研究通过比较72名先兆子痫患者和452名非先兆子痫患者血浆样本的cfRNA图谱特征，鉴定出了7个在病例组和对照组中差异表达的基因，其中4个基因已被报道与先兆子痫或胎盘发育相关。

该研究还建立了一个逻辑回归模型预测，使用cfRNA特征预测先兆子痫的发病概率，并对该模型进行评估，结果表明该模型可以有效预测先兆子痫，灵敏度达75%，阳性预测值为32.3%，AUROC为0.82。

总之，这项研究通过分析母体血浆cfRNA图谱的非侵入性产前监测技术，能够全面评估孕期生理状况，提前预测重大并发症风险，对产前筛查具有重大意义。

3. 基于cfRNA液体活检用于检测胃肠道癌症的方法[3]

2023年11月21日，清华大学鲁志、卢倩团队与北京大学王鹏远团队联合在《Cell Reports Medicine》发表题为“Cell-free multi-omics analysis reveals potential biomarkers in gastrointestinal cancer patients' blood”的研究文章。该研究基于cfRNA和cfDNA的多组学分析揭示了胃肠道癌症患者血液中潜在生物标志物，研究发现cfRNA在检测与癌症相关基因方面比cfDNA更敏感，且cfRNA标志物可监测癌症阶段和生存状况。

图5. cell-free多组学研究思路

该研究整合多组学（包括cfMeDIP-seq、cfWGS、cfRNA-seq）分析了15种细胞外分子变异。研究发现多组学数据比单一组学更适合用于检测癌症基因。在检测癌症相关基因、富集的功能通路等方面，cfRNA比cfDNA更敏感，信息更丰富。此外，研究人员识别出几个在癌症患者中被抑制的外周免疫标记这可能反映了肿瘤对宿主免疫系统的影响。

作者使用先前发表的数据（GSE174302）对143个来自结直肠癌（CRC）和胃腺癌（STAD）患者的cfRNA测序数据集进行了调查，研究结果发现血液中的cfRNA生物标志物能够预测患者的临床状态,如癌症分期和预后生存率。

总之，这项研究通过对胃肠道癌症患者的多组学分析，发现cfRNA比cfDNA更敏感地反应了肿瘤相关的分子特征，揭示cfRNA作为无创癌症检测和个性化治疗的新兴生物标志物的潜力。

4. cfRNA用于癌症早期筛查[4]

2021年4月21日，美国GRAIL公司Matthew H Larson团队在《Nature communications》发表题为“A comprehensive characterization of the cell-free transcriptome reveals tissue- and subtype-specific biomarkers for cancer detection”的研究文章。该研究基于cfRNA进行了全面转录组水平的分析，揭示了癌症检测的组织和亚型特异性生物标志物，研究发现cfRNA在癌症早期筛查中是一种有潜力的生物标志物，有助于预测肿瘤的组织来源和确定癌症亚型。

作者通过对cfRNA片段长度和RNA类型进行分析，结果发现cfRNA在血浆中相对稳定，其片段长度分布与外泌体RNA相似。

图6. cfRNA的分析表征

通过组织去卷积分析发现，非癌症患者血浆cfRNA主要来源于血液细胞和肝脏、脾脏组织。在癌症患者中，cfRNA也来源于肿瘤组。

在57,820个注释基因中，有39,564个(68%)在非癌症个体的cfRNA中未被检测到，这些区域被称为"暗通道"，发现了在癌症患者cfRNA中反复检测到的基因DCB。DCB具有组织特异性，与匹配肿瘤组织中RNA表达呈正相关。部分DCB的表达与癌症的分型相关。DCB基因的检测与肿瘤含量相关，而不仅仅是肿瘤分数或组织表达。作者通过靶向富集方法验证了23个cfRNA生物标志物中，发现15个在癌症患者中具有诊断价值，进一步证实了DCB发现方法的有效性。

总之，这项研究深入探究了cfRNA的特性，发现了组织和亚型特异性的DCB基因，揭示了cfRNA在癌症检测、预测肿瘤起源组织和确定亚型方面新的视角。

5. 血浆cfRNA为检测结核病的宿主反应生物标志物[5]

2024年6月10日，康奈尔大学Iwijn De Vlaminck团队联合在《Nature communications》发表题为“Circulating cell-free RNA in blood as a host response biomarker for detection of tuberculosis”的研究文章。该团队使用RNA测序和机器学习探究cfRNA作为结核病的宿主反应生物标志物的应用潜力。研究发现了一种6个基因组成的cfRNA特征，该特征可区分不同地理等背景的结核病阳性和阴性个体，具有较高的准确性和特异性，符合世界卫生组织的标准。

图7. cfRNA分析结果概况

作者采用病例对照研究设计，分析了三个国家251份样品个体的cfRNA特征，研究发现结核阳性组与阴性组在巨噬细胞、中性粒细胞、干扰素和抗菌基因表达方面存在显著差异。通路分析显示,中性粒细胞脱颗粒、干扰素信号通路和抗菌肽合成是与结核病相关的主要生物学过程。

通过RNA测序和机器学习发现的6基因（GBP5、BNIP3L、KLF6、DYSF、LASP1 和 PCBP1）cfRNA特征在训练集、测试集和验证集上分别达到95.0%、92.7%和91.8%的诊断精度，且与地理位置、样本采集方法和HIV状态无关。

总之，这项研究证实了血浆cfRNA是一种具有应用前景的结核病宿主反应生物标志物。

生物标志物挖掘过程中的主要挑战改进方法[6]

 研究思路

按照数据分析步骤，研究思路分成了发现集、训练集和验证集阶段。已有的研究、前期实验发现和测序结果，均可归为发现集。在发现集中，具有HEBER-seq和PANDORA-seq两项技术，前者可检测cell-free mRNA和lncRNA，后者可检测cell-free miRNA、piRNA、tsRNA和rsRNA，这两项技术全范围覆盖了longRNA以及sncRNA（small non-coding RNA）；挖掘新的液体活检生物标志物；在训练集和验证集研究阶段，可提供IPA分析服务以及基于机器学习算法的疾病诊断/预后评估模型构建服务，高效预测生物标志物或治疗靶点！

参考文献

1. Moufarrej MN, Vorperian SK, Wong RJ, et al. Early prediction of preeclampsia in pregnancy with cell-free RNA. Nature. 2022;602(7898):689-694.

2. Rasmussen M, Reddy M, Nolan R, et al. RNA profiles reveal signatures of future health and disease in pregnancy. Nature. 2022;601(7893):422-427.

3. Tao Y, Xing S, Zuo S, et al. Cell-free multi-omics analysis reveals potential biomarkers in gastrointestinal cancer patients' blood. Cell Rep Med. 2023;4(11):101281.

4. Larson MH, Pan W, Kim HJ, et al. A comprehensive characterization of the cell-free transcriptome reveals tissue- and subtype-specific biomarkers for cancer detection. Nat Commun. 2021;12(1):2357. 

5. Chang A, Loy CJ, Eweis-LaBolle D, et al. Circulating cell-free RNA in blood as a host response biomarker for detection of tuberculosis. Nat Commun. 2024;15(1):4949.

6. Cabús L, Lagarde J, Curado J, Lizano E, Pérez-Boza J. Current challenges and best practices for cell-free long RNA biomarker discovery. Biomark Res. 2022;10(1):62.