最新11分生信，铜死亡+分型+机器学习+单细胞验证+样本验证，热点分型+机器学习反复出现在高分文章中!

影响因子：11

研究概述：脑海绵状血管畸形（CCMs）是一种常见的神经血管畸形，可以以散发或家族形式出现在年轻成年人中。这些畸形的特点是静脉毛细血管床的血管异常扩张，没有间隔的脑实质。这种畸形的血流速度慢，容易形成血栓。患者终生面临中风、癫痫和局灶性神经功能缺损的风险，目前尚无有效的药物治疗。到目前为止，尽管发现了与血管生成、血管生成和血管重塑相关的基因和遗传风险因素，但CCMs的精确发病机制尚不清楚，治疗方法也未确定。铜死亡（cuproptosis）是一种新发现的细胞死亡形式，与线粒体代谢有关，显著不同于已知的细胞死亡形式如凋亡、铁死亡和坏死。研究表明，铜死亡依赖于线粒体呼吸，由细胞内铜的缺乏或过量引发。细胞内铜过量可转运至线粒体，与三羧酸循环（TCA循环）中的脂肪酰化成分直接结合，导致蛋白质毒性应激并最终导致细胞死亡。基于全基因组CRISPR-Cas9筛选，已鉴定出多种与铜死亡相关的基因（CRGs）。本研究旨在通过综合方法探讨铜死亡在CCMs进展中的潜在作用，分析不同CCMs亚型中CRGs的贡献，筛选与铜死亡相关的关键基因，并在外部数据集和本研究中的CCM样本中验证这些基因。此外，研究还探讨了这些关键基因与CCMs免疫微环境之间的相互作用，提供了免疫调节在疾病进程中的新见解。这些结果可能为了解CCMs发展的多样性和复杂机制提供宝贵的见解，并为潜在的治疗策略铺平道路。具体流程如下：

本文生信部分本质上是通过分型进行分组，对比不同组的各种差异，然后进行评分，比较分数与肿瘤微环境的关系。

研究结果：

CCMs和对照组中的铜死亡相关的基因CRGs表达

作者分析了从21名患者获得的两个GEO表达谱数据，其中对照组6名，CCMs组15名（图2A）。作者发现CCMs组和对照组之间共有2963个差异表达基因（DEGs），其中1169个基因在CCMs中上调，1794个基因下调（图2B）。随后进行的GO富集分析发现，上调的基因主要富集在与免疫和血管生成相关的通路中（图2C）。为了进一步研究CRGs在CCMs中的表达模式，作者探究了铜死亡基因在其中扮演的作用。研究结果表明，四个铜死亡基因（CDKN2A, GLS, PDHA1, 和 PDHB）在对照组和CCMs组之间存在显著表达差异（图2D-F）。其中，CDKN2A在CCMs中高表达，而GLS, PDHA1, 和 PDHB在对照组中高表达。此外， CRGs的相关性分析结果显示，FDX1与CDKN2A和DLD呈正相关，而GLS与CDKN2A和FDX1呈负相关（图2G）。随后作者采用CIBERSORT算法评估了样本的免疫浸润情况。分析结果表明，与对照组相比，CCMs中存在显著的免疫细胞浸润，包括巨噬细胞、树突状细胞、B细胞和T细胞（图2H）。进一步分析CRGs与免疫细胞的关系显示，大多数CRGs与趋化因子受体、T细胞、抗原提呈细胞、树突状细胞和滤泡辅助性T细胞呈正相关，而与APC共抑制、旁炎症、调节性T细胞、I型干扰素反应、肿瘤浸润淋巴细胞、人类白细胞抗原和巨噬细胞呈负相关（图2I）。

基于CRGs的聚类分析

基于CRGs表达差异，作者采用consensus clustering方法来研究CCMs中铜死亡的模式，最终确定了两个不同的聚类（Cluster 1与Cluster 2；图3A-F）。Cluster 1与Cluster 2之间有281个基因上调，266个基因下调（图3G）。GO富集分析表明，这些DEGs主要富集在免疫调节、血管发育和突触相关的功能中（图3H）。进一步分析这些聚类中的CRGs表达，发现有七个基因表现出差异表达（CDKN2A, FDX1, LIAS和LIPT1在Cluster 1中高表达，而GLS, PDHA1和PDHB在Cluster 2中高表达）（图3I）。由于既往文献表明FDX1和LIAS在铜死亡诱导的细胞死亡中起正调控作用，而GLS起负调控作用，Cluster 1中的患者可能更容易经历铜死亡的正向促进，而Cluster 2中的患者可能获得相反的调控效果。最后，作者进行了GSEA富集分析（图3J, K）。结果发现：葡萄糖醛酸转移酶活性在Cluster 1的基因高表达组中显著激活，而腺苷酸环化酶结合在Cluster 2的基因高表达组中激活（图3J）。此外，抗坏血酸与醛糖酸代谢和细胞色素P450代谢主要富集在Cluster 1中，而糖基磷脂酰肌醇合成和柠檬酸循环TCA循环富集在Cluster 2组中（图3K）。

不同亚型CCMs相关的关键基因识别

上文提及，作者在Cluster 1和Cluster 2之间、CCMs组与对照组之间筛选了DEGs，在此基础上，作者发现其中交集有273个DEGs（图4A）并进行LASSO回归和随机森林分析。其中，LASSO分析共识别出14个与CCMs相关的特征基因（图4B和4C）。随机森林则选出了10个特征基因（图4D）。将者两种算法的结果交集得到了三个重叠基因，即PFDN4、CEMIP和BTBD10（图4E），这些基因被作为后续研究的关键基因。比较两个聚类发现，BTBD10和PFDN4在Cluster 1中高表达，而CEMIP在Cluster 2中高表达。此外，所有三个基因在CCMs中显著上调（图4F和4G）。在GeneCards数据库中，作者还鉴定了与CCMs相关的致病基因，其中，BRAF、TNF、SYNGAP1、DLL4和ARID1B在Cluster 1中高表达；PIK3R2、NR2F2、TGFB1和ZIC1在Cluster 2中高表达（图4H）。进一步分析表明，三个关键基因的表达水平与多种疾病相关基因显著相关，包括BTBD10与DLL4之间的正相关（r = 0.887, P<0.001）以及PFDN4与ENG之间的负相关（r = -0.725, P<0.001）（图4I）。

CCMs亚型的免疫浸润特征

既往文献报道CCMs的免疫微环境主要由免疫细胞、细胞外基质、各种生长和炎症因子以及独特的理化特性组成。作者通过ssGSEA分析发现Cluster 1和Cluster 2之间在多种免疫细胞中存在显著差异，包括活化的树突状细胞、B细胞、检查点、DCs、促炎细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、浆细胞样树突细胞、T细胞共抑制、辅助性T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞和II型干扰素反应。总的来说，Cluster 2的免疫浸润水平显著高于Cluster 1（图5A）。随后作者采用CIBERSORT算法验证ssGSEA的结果，得到了相一致的结果（图5B）：巨噬细胞，特别是M0和M2类型，占所有免疫细胞的显著比例（图5C）。此外，作者还发现来自Cluster 1的关键基因BTBD10和PFDN4与大多数免疫细胞，包括巨噬细胞和B细胞，呈显著负相关（图5D和5F）。相反，来自Cluster 2的关键基因CEMIP与大多数免疫细胞呈显著正相关（图5E）。

关键基因的信号通路富集分析

既然三个关键基因（BTBD10、CEMIP、PFDN4）如此重要，接下来作者便探讨它们可能通过哪些分子机制影响CCMs的进展。GSVA结果显示，BTBD10高表达时，主要激活的信号通路包括mTORC1信号通路、脂肪酸代谢和PI3K-AKT-mTOR信号通路（图6A）。CEMIP高表达时，主要富集在IL6/JAK/STAT3、血管生成、TNFA通过NFκB的信号传导和炎症反应信号通路中（图6B）。而PFDN4高表达则显著富集在胆汁酸代谢、KRAS信号和脂肪酸代谢通路中（图6C）。此外，GSEA分析结果表明，BTBD10在化学趋化因子、NOD样受体和Toll样受体信号通路中富集（图6D）；CEMIP在cAMP信号通路、谷氨酸能突触和逆行内源性大麻素信号通路中富集（图6E）；PFDN4则富集在钙信号通路、cAMP信号通路和神经活性配体-受体相互作用通路中（图6F）。

关键基因在人类内皮细胞（ECs）中的验证

为了验证CCMs中关键基因的表达和功能，作者在人类CCMs的数据集GSE233210进行验证（图7A）。在CCMs_ECs和对照正常ECs的比较中，共识别到149个上调的DEGs和9726个下调的DEGs（图7B）。上调的DEGs主要富集在与免疫调节和血管发育相关的通路中（图7C），这与之前的分析结果一致（图2C）。在CRGs的表达方面，CDKN2A、FDX1、LIAS、BTBD10、PFDN4和CEMIP在CCMs_ECs组中上调，而GLS、MTF1和PDHB在对照_ECs组中上调（图7D-E）。相关性分析结果显示，BTBD10和PFDN4在与CRGs的关系分析中表现出一致性，显著正相关于FDX1、LIAS和DLAT，而显著负相关于GLS和PDHA1（图7F）。CEMIP与FDX1、LIAS和DLAT显著负相关，而与GLS和PDHA1显著正相关（图7F）。免疫浸润分析结果显示，CCMs_ECs组的免疫细胞浸润高于对照组（图7G），这与之前的CCMs总体样本分析结果一致。关键基因与免疫细胞的相关性分析表明，BTBD10和PFDN4与大多数免疫细胞呈负相关，而CEMIP与免疫细胞呈正相关（图7H-J）。

在本医院中心队列中验证关键基因

为了进一步确认这些关键基因在CCMs中的表达，作者对自己医院中心的队列中CCMs样本进行了免疫荧光共定位和蛋白表达水平评估。BTBD10、CEMIP和PFDN4在CCMs组织中与VE-cadherin（ECs的标志性蛋白）共定位（图8A）。而CCMs组中的BTBD10、CEMIP和PFDN4水平显著高于对照组，表明这些关键基因在CCMs组织中功能性表达（图8B-E）。

单细胞水平验证关键基因

作者分析了来自scRNA-seq数据集（GSE155788）的4个样本（2个正常样本，2个CCMs样本）。共获得14623个正常组织细胞和15978个CCMs组织细胞。细胞被分类为五种主要类型，包括红细胞、巨噬细胞/小胶质细胞（MΦ/MG）、胶质细胞、内皮细胞和神经细胞（图9A）。其中，内皮细胞可被细分为七个亚群，包括动脉、动脉毛细血管、静脉毛细血管、静脉毛细血管（Mki67+）、静脉、尖端细胞和尖端细胞（Mki67+）（图9B-C）。共表达分析中，Btbd10和Pfdn4在CCMs的多个内皮细胞中共表达，特别是在Cluster 1中（图9C）。与对照组相比，Btbd10和Pfdn4在CCMs的尖端细胞（Mki67+）中高度表达（图9D）。随后进行的相关性分析结果表明Btbd10在多个细胞亚群中与多个CRGs显著相关，特别是在尖端细胞（Mki67+）中与Fdx1、Mtf1和Gls呈正相关。因此，Btbd10在内皮细胞中的作用成为后续探索的重点。

Btbd10调节CCMs的潜在铜死亡机制

作者通过细胞通讯分析发现，对照组与CCMs样本之间的细胞间相互作用存在显著差异，特别是MΦ/MG与大多数其他细胞之间的相互作用强度显著增强（图10A）。作者将MΦ/MG分为M1和M2两个亚群，探讨它们在CCMs样本中高表达关键基因的内皮细胞之间相互作用（图10B）。结果显示，M2 MΦ/MG与Btbd10+内皮细胞和Pfdn4+内皮细胞之间的相互作用强度高于其他细胞，表明这两个内皮细胞亚群在与M2 MΦ/MG的相互作用中可能起主要功能作用。然而，Cemip+内皮细胞与M2 MΦ/MG之间的相互作用较弱，表明Cemip+内皮细胞与M2 MΦ/MG之间的相互作用可能不是主要功能相互作用（图10B）。进一步深入分析了发现高表达关键基因的内皮细胞与MΦ/MG之间主要通过Ptn-Ncl和Fn1-(Itga4+Itgb1) 配体通路进行通信（图10C）。在M2 MΦ/MG与Btbd10+内皮细胞之间的主要通信通路是通过Ptn-Ncl通路， Btbd10+内皮细胞与M2 MΦ/MG之间的通信主要通过Fn1-(Itga4+Itgb1)通路（图10D）。

Btbd10与铜死亡的关键基因Fdx1在CCMs样本的尖端细胞（Mki67+）中显著正相关，而在对照组中无显著相关性（图11A）。进一步的共定位结果也提示Btbd10和Fdx1在尖端细胞（Mki67+）中的共表达（图11B）。这些结果表明Btbd10与CCMs细胞水平的铜死亡存在重要关联。因此，作者进一步细化出CCMs样本中的尖端细胞（Mki67+），并通过细胞通讯分析了它们与其他细胞群的相互作用。结果发现，尖端细胞（Mki67+）与MΦ/MG，特别是M2 MΦ/MG之间的相互作用强度显著（图11C）。同时，与低表达Btbd10的尖端细胞（Mki67+）相比，高表达Btbd10的尖端细胞（Mki67+）与M2 MΦ/MG之间的相互作用强度显著增加（图11D）。最后，作者分析了高表达和低表达Btbd10的尖端细胞（Mki67+）与M2 MΦ/MG之间的配体-受体通路，发现它们主要通过Esam-Esam、Col4a1-(Itga1+Itgb1)和Ptn-Ncl配体通路进行相互作用（图11E）。其中，M2 MΦ/MG与高表达Btbd10的尖端细胞（Mki67+）之间的主要相互作用通路是通过Esam-Esam配体通路，而M2 MΦ/MG与低表达Btbd10的尖端细胞（Mki67+）之间的主要相互作用通路是通过Col4a1-(Itga1+Itgb1)和Ptn-Ncl（图11F）。这些发现表明M2 MΦ/MG可能通过上述配体-受体通路与尖端细胞（Mki67+）相互作用，并驱动尖端细胞（Mki67+）中的铜死亡过程，其中Btbd10可能在促进铜死亡中发挥作用。

研究总结：

这篇研究发现CCMs中存在两种不同的亚型，其CCMs亚型的DEGs表达和免疫浸润情况不同。确定并验证了三个关键CRGs基因（BTBD10, PFDN4, CEMIP），这些基因可能与CCMs的病理进展密切相关，并在CCMs的内皮细胞中显著上调。此外，单细胞RNA测序分析揭示了这些关键基因的细胞共表达模式，特别是BTBD10和PFDN4在内皮细胞中的高表达，以及BTBD10与关键铜死亡基因FDX1在Mki67+尖端细胞中的共定位。这些发现表明铜死亡在CCMs血管生成中的重要作用，并提示了这些基因与免疫细胞之间的相互作用在CCMs发病机制中的潜在角色。