RNA原位杂交之切片

样品的固定、包埋和切片是生物医学研究、组织学分析和病理学诊断中非常重要的步骤，正确操作有助于保持组织结构的完整性、保存生物分子的空间位置以及获得高质量的实验结果。上期我们介绍了关于样品固定与包埋的相关内容[插入对应推文链接]，这期小编继续为大家介绍样品固定包埋之后的又一关键步骤——切片。切片结果的好坏将直接影响后续实验如原位杂交、免疫组化等检测效果。

目前最常用的两种组织切片方法是冰冻切片和石蜡切片，两种方法在原理与流程上存在差异，不同的优缺点使得两种方法在应用范围上也有所不同。小编就以这两种切片方法展开介绍。

表1两种切片方法对比

冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷冻到一定硬度，然后进行切片的方法，制作过程较石蜡切片快捷、简便。

冰冻组织切片流程：

1、切片前准备

1)包埋块需提前置于-20℃进行温度平衡，时间与组织大小成正比，以鼠脑为例，平衡时间需一小时以上。

2)准备切片所需器具(如载玻片、铅笔、毛笔、刀片、切片盒、OCT 包埋剂、RNase去除剂等)，切片前需先确定组织目标区域。

3)如果切片用于RNA分子的原位杂交检测，需要在切片机工作区域喷洒RNase去除剂。

4)开启冰冻切片机，设置合适的切片机箱体和样品头温度；一般制备鼠脑切片的箱体温度设置为-20℃，样品头温度设置为-22℃，可按实际情况进行调整。

5)使用工具预冷，如刀片、毛笔等。

6)包埋块预修剪，将包埋块切面修剪为适合的大小和形态，切面以方形为宜。

7)玻片提前做好标记，标注样本名称、切片厚度、切片日期等。

2、切片流程

由于组织类型多样，实验人员手法习惯也不尽相同，对于冰冻切片的方法资料也挺多，这里提供一种小编常用的切片方式以供参考和选择。

1)切片时将防卷板打开，一边匀速转动手轮向下切，一边用预冷过的毛笔向外牵引组织切片使其展平，不要完全切完，留有一小段OCT粘连，如下图。（注意：毛笔不要太用力拉扯，先将切片向下牵引，不用拉直，切停后，毛笔继续牵引平整，注意动作轻柔平缓，防止破坏组织。）

2)展平切片后，松开毛笔，手轮反方向转动，直到锁定点，锁死手轮。

3)用毛笔将切好的组织向下捋直，先按压组织上方OCT，然后顺着组织右边OCT轻轻向下捋，到组织下方用毛笔按压固定后，松开毛笔如下图。

4)取标记好的载玻片，使载玻片与组织块切面平行并稍向左下倾斜5°左右，使玻片先靠近左下方OCT，匀速靠近切片，使切片吸附于载玻片上，同时玻片向上回正使玻片完全与切面平行，如下图。（注意：载玻片贴片时，玻片不能停留在组织切面上，防止切下的组织粘在包埋块上。）

5)检查切片组织完整度，是否有缺失、形变、褶皱、气泡。

6)将切片置于-80℃冰箱保存，建议在1个月内开展RNA原位杂交实验为最佳（前期进行固定处理的组织）。

石蜡切片（paraffin section）是组织学常规制片技术中最常用的方法，不仅用于观察正常细胞组织形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织形态变化的主要方法，已广泛用于生命科学领域的研究。

石蜡组织切片流程：

1、切片前准备

[1) 提前30 min打开展片烤片机进行预热。

2) 准备切片所需器具(RNase去除剂、载玻片、铅笔、毛笔、刀片、切片盒)，确定组织切片目的区域。

3)载玻片提前做好切片标记，标注样本名称、切片厚度、切片日期等。

2、切片流程

1) 修块：调整组织包埋块切面，一般修片厚度20-30 μm，根据组织情况调整，如组织较硬较小可适当减少修片厚度，修片至组织暴露完整即可。

2) 切片：切片时手轮转动应匀速、不宜过快或过慢，切片时可用毛笔牵引向外，一般15 cm左右或5-10片进行展片，如下图。（注意：组织的层次，纤维、肌肉等走向应与切片刀平行，较难切的部位应放于上面，保证切片完整性。）

3) 展片：使用镊子或毛笔将切片转移至展片池，放入展片池注意动作连贯，防止切片堆折，使用弯镊分离单个切片，如下图。（注意：展片温度一般40℃左右，如果组织展片时容易裂散，可适当降低展片温度。）

4) 捞片：可用弯镊将展片池中连续切片进行分离，捞片时可以用镊子固定切片另一端防止切片被水流带动。

5) 烤片：烤片一般设置60℃ 1 h以上。

6) 保存：常温或4℃冰箱保存，切好的组织切片建议在三个月内开展RNA原位杂交实验为最佳。

3、其他注意事项如下：

a. 确保蜡块冷冻：冷冻石蜡可为标本中的较硬成分提供更好支持，以获得更薄的切片（可使用4℃冰箱或冰袋冷冻，如下图），尤其是过度脱水、过度干燥或易碎组织。

b. 及时清理碎片：蜡块上部或下部边缘或刀片背面存在的碎片需及时清理，防止切片与组织块粘连卷片。

综上所述，针对不同样品类型和实验需求，选择合适的切片方式至关重要。正确而规范的切片操作是确保获得高质量组织样品实验结果的关键步骤。这不仅有助于后续准确分析细胞形态、组织结构和生物分子空间分布，还能为研究提供可靠的基础数据。未来，小编将持续为大家提供基因原位杂交技术相关专业知识，分享实验技巧和最新研究进展，帮助大家更好地理解并应用这些技术。敬请期待更多干货内容，以助于您的科研工作和学习。