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【题目】Exploring new frontiers: cell surface vimentin as an emerging marker for circulating tumor cells and a promising therapeutic target in advanced gastric Cancer

【期刊】nature cell biology

【发表时间】2024年4月30日

【IF】11.4

【单位/通讯作者】中国医科大学附属第一医院赵明芳/李贺明团队和上海中医药大学胥孜杭团队

【关键词】胃癌；生物标志物；细胞表面波形蛋白；循环肿瘤细胞

2024年4月30日，中国医科大学附属第一医院赵明芳/李贺明团队和上海中医药大学胥孜杭团队联合在《Journal of Experimental &Clinical Cancer Research》发表题为“Exploring new frontiers: cell surface vimentin as an emerging marker for circulating tumor cells and a promi csing therapeutic target in advanced gastric Cancer”的研究论文。这项研究探讨了利用细胞表面波形蛋白（Cell surface vimentin，CSV）作为一种新型的循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells，CTCs）检测标志物在胃癌中的应用，研究结果揭示了CSV在预测晚期胃癌患者的治疗和预后方面的潜力，且证实了同时抑制CSV和IGF-IR信号通路具有抑制胃癌转移的潜力，提供了新的治疗靶点。

图1. 研究概述

研究思路

1. 基于CSV的CTCs检测平台，具有高灵敏度和特异性 

该研究为评估CSV在鉴定胃癌（Gastric cancer，GC）患者CTCs方面的敏感性，进行了使用CFSE(细胞增殖荧光探针)标记的BGC-823 GC细胞进行了血液峰值试验，结果表明抗体能够从外周血单核细胞中识别少量细胞，线性回归分析显示，刺突细胞数量与回收率呈正相关（p<0.05）。CSV+CTCs检测方法对GC样本具有高度敏感性。

为验证CTCs的肿瘤来源，该研究通过IHC、HE、对晚期GC患者样本进行WES（全外显子测序）的方法，研究结果表明CSV可作为GC患者CTCs检测新的生物标志物。

图2. 用CSV抗体检测外周血样本中的CTCs，通过血液峰值试验和WES进行验证

2. EpCAM与CSV分离方法所得数据的比较 

该研究使用CSV和EpCAM抗体方法对127例GC患者的血液样本进行了CTCs捕获，结果表明CSV 84-1抗体具有高特异性。

另外，与EpCAM方法相比，CSV方法在不可切除晚期GC患者中检测到更高水平的CTCs。

图3. A）CSV和EpCAM方法在可切除和不可切除GC患者中CTCs的阴阳性对比；B）CSV+CTCs计数与EpCAM+CTCs计数的比较

3. CSV+CTCs与晚期GC患者的治疗反应和预后不良相关 

该研究使用EpCAM+CTCs方法对66名晚期GC患者进行研究分析，结果发现CSV+CTCs阳性率与高PS评分、年龄大和治疗反应差显著相关，且CSV+CTCs计数高于EpCAM+CTCs计数。

比例分析显示，具有CSV/EpCAM比例（M/E）>1的患者大多数属于PD组。这表明CSV+CTCs在预测晚期GC患者治疗反应方面优于EpCAM+CTCs。

图4. C）Stable患者和PD患者CSV+CTCs计数与EpCAM+CTCs计数的比较；D）上皮（蓝色）和间质（红色）表型的CTCs计数

通过ROC（受试者工作特征）分析，结果表明CSV+CTCs与EpCAM+CTCs在早期可切除GC患者中均无法预测DFS（无病生存期）。此外，Cox回归模型显示，CSV+CTCs与内脏转移和治疗策略的结合关联晚期GC患者的不良预后。

4. CSV法对GC合并PD患者的评估更敏感、更特异，其检测CTCs比影像评估更早预测治疗反应 

该研究通过热图分析、ROC等方法，结果发现CSV+EpCAM方法在预测疾病结果方面更优，但在评估PD患者和Stable患者时不如CSV法。

该研究分析了16名根据RECIST 1.1（实体瘤疗效评价标准）初步确认病情稳定的晚期GC患者的CTCs检测结果，也比较了使用不同CTCs检测方法预测PD时间与影像学预测的PD时间差异。结果证实CSV法进行CTCs富集可更早预测治疗反应。

5. CSV表达与GC的转移潜能相关 

该研究通过流式细胞术和IF法对不同GC细胞系进行一系列体外实验，GC细胞的迁移能力与CSV表达和EMT表型呈正相关。

进一步通过建立的肺转移小鼠模型进行研究评估，并注射BGC-823细胞。与用于CTCs富集和免疫荧光染色的84-1抗体不同，Pritumumab(普林木单抗是一种通过与CSV结合诱导胶质瘤细胞死亡的治疗性抗体)具有抗肿瘤潜力，并显著延长了肺转移模型小鼠的生存期。

流式细胞术分析进一步证实了Pritumumab组的CSV+CTCs数量显著减少。然而，CSV+GC细胞未在皮下异种移植瘤中检测到。这些结果表明，CSV表达与GC转移能力正相关，阻断CSV表达的普林木单抗可能成为治疗转移性GC的新药物干预手段。

6. m6A RNA去甲基化基因（FTO）调控晚期GC中CSV 

既往研究显示m6A RNA修饰在各种癌症的EMT(上皮间质转化)过程中起重要作用。该研究分析了300名晚期GC患者的m6A 甲基化模式，重点关注FTO和ALKBH5(去甲基化酶基因)。研究将患者分为两类：EraserCluster A（ALKBH5过表达）和EraserCluster B（FTO过表达），研究发现发现EraserCluster B与EMT过程、中晚期GC及预后不良显著相关。

又通过GO分析和GSVA分析，结果表明EraserCluster B与免疫抑制和癌症相关的生物过程有关，并显示出增强的基质活性。这些结果表明，FTO通过调控EMT过程，参与CSV表达和CSV+CTCs的形成。

图5. 300名GC患者队列的m6A甲基化模式

7. FTO通过调节CSV表达促进胃癌转移

该研究通过HGC-27细胞的FTO敲低实验，发现在HGC-27中敲低FTO或使用FB23-2（FTO特异性抑制剂）可显著降低GC细胞的转移和增殖能力。通过Transwell实验和细胞克隆形成，发现CSV的表达水平显著降低，进一步验证FTO对GC转移的影响。此外，在肺转移小鼠模型中，FB23-2表现出抗转移活性。

又通过体内研究，结果显示在皮下异种移植中缺乏CSV+GC细胞，而不像肺转移模型中明显存在，强调了CSV在通过血液促进癌症转移中的作用。

8. GC中FTO潜在靶基因的鉴定 

该研究通过m6A-seq和RNA-seq，确定了FTO在GC中的潜在靶基因。研究发现敲低FTO会导致基因组CDS和3'-UTR中m6A富集增加，但对5'-UTR影响较小。此外，在对照组和FTO敲低细胞中分别鉴定出3608个4930个m6A基因。GGAC motif在FTO敲低细胞中m6A位点高度富集。

进一步分析316个EMT相关基因、3405个m6A调控基因和1659个改变基因，其中IGF-IR被选作EMT的关键因子。对这些基因的GO分析也揭示了它们与细胞连接和EMT调控有潜关联。

该研究还通过MeRIP-qPCR和SELECT-m6A试剂盒验证了IGF-IR mRNA的m6A修饰，结果抗m6A抗体显著富集了FTO敲低GC细胞中IGF-IR的mRNA水平，FTO去甲基化后，IGF-IR的m6A修饰CT值显著降低。此外，公共数据库分析结果显示，在泛癌中FTO表达水平较高，其与IGF-IR水平和不良预后呈正相关。

综上，这些结果表明IGF-IR是GC中FTO的潜在靶基因。

图6. A）FTO组与对照组的m6A修饰metagene图；B）对照组与si-FTP HGC-27细胞中m6A修饰基因的数量

图7. C）FTO敲低的HGC-27细胞中m6A富集鉴定的motif；D）对照组与si-FTO组mRNA转录本中m6A富集分布比例；E）FTO敲低后的m6A富集的转录本与差异表达基因重叠的韦恩图

图8. FTO敲低的HGC-27细胞中下调基因的生物过程类别中GO富集气泡图

9. YTHDF2介导的RNA衰变调节FTO靶基因的表达 

该研究调查了YTHDF家族成员如何通过m6A RNA修饰影响FTO在调节IGF-IR表达中的调控作用。研究发现敲低YTHDF1或YTHDF3对IGF-IR或IGF-I mRNA水平无影响。但在对照组中，敲低YTHDF2显著增加IGF-I和IGF-IR的mRNA表达，但在敲低FTO的GC细胞中逆转。敲低FTO降低了IGF-I和IGF-IR mRNA稳定性，反之敲低YTHDF2增加了FTO敲低的GC细胞中IGF-IR mRNA稳定性。

10. 通过分子对接和分子动力学模型进一步确定IGF-IR为FTO的直接靶点 

该研究使用分子对接分析了配体-蛋白相互作用，结果显示当IGF-IR共晶化合物重新对接到IGF-IR活性位点时，RMSD值为1.168Å，表明分子对接方法的可靠性。

为了进一步确认IGF-IR和FB23-2复合物的稳定性和行为，进行了100 ns的分子动力学模拟，发现蛋白骨架和配体的RMSD曲线稳定，波动分别在2.6Å和2.9Å左右。

总的来说，复合物的稳定性、一致的结合模式以及在柔性环区域的波动支持FB23-2与IGF-IR形成稳定可靠的相互作用，表明其具有很强的结合亲和力。这些发现进一步支持了IGF-IR作为FTO直接靶基因的鉴定。

11. IGF-IR信号通路在调节CSV表达中的意义 

通过GSEA分析发现与IGF-I/IGF-IR信号通路相关的基因集中EMT进程的正向富集（NES=1.82；FDR=0.052）。

使用TMT定量蛋白质组学分析，结果显示IGF-I刺激组中33种与EMT相关的蛋白质表达水平显著增加。

GO富集分析表明，这些差异表达的蛋白质主要参与EMT、膜钙粘蛋白结合和生长因子结合。进一步分析识别出15条关键的IGF-I相关通路，这些通路表现出显著的富集。此外，通过PPIs分析，在IGF-I刺激组中发现7种蛋白质直接与IGF-IR信号通路相互作用。

总之，这些结果进一步支持了IGF-IR信号通路在EMT过程中的关键作用以及对CSV表达的调控作用。

图9. GSEA分析结果显示与IGF-I/IGF-IR信号通路相关的基因集在EMT过程

12. IGF-I诱导的波形蛋白磷酸化和易位增强了GC细胞中CSV的表达 

为研究IGF-IR信号通路在GC细胞中对CSV表达的调控机制，该研究使用流式细胞术、亚细胞定位的分析、磷酸化位点分析等试验，结果发现IGF-I诱导的CSV通过波形蛋白磷酸化从细胞质转移到细胞表面，IGF-IR信号通路的激活可能通过促进CSV的转移上调GC细胞中的CSV表达。

13. 抑制CSV与IGF-IR抑制剂联合使用可抑制裸鼠CSV+CTCs的形成与转移 

最后，该研究探讨了普林木单抗和GSK1838705A（一种有效且可逆的IGF-IR和胰岛素受体抑制剂）联合治疗对肺转移小鼠模型中CSV表达和GC转移的影响。通过体内实验、IHC、WB等试验，研究结果发现普林木单抗和GSK1838705A均表现出显著的抗肿瘤效果，但联合治疗效果更显著。普林木单抗、GSK1838705A及其联合治疗组中，CSV+CTCs数量显著减少。

IHC结果显示，肺肿瘤组织中E-钙粘蛋白表达增加，而CSV和FN1表达减少，表明EMT过程受到抑制。

IHC和WB分析结果显示，普林木单抗、GSK1838705A及其联合治疗组中p-AKT和NF-κB表达显著抑制。

总之，这些结果表明联合使用普林木单抗和GSK1838705A不仅抑制了CSV表达，还通过抑制EMT和IGF-I信号通路，显著延长了肺转移小鼠的生存时间。

讨 论

这篇研究文章进行了一项前瞻性研究，比较了使用EpCAM和CSV特异性抗体84-1检测GC患者CTCs的差异。CSV特异性抗体84-1是一种验证过的通用标志物，可用于识别各种肿瘤类型中的EMT-CTCs。研究发现，CSV+CTCs方法能够更准确地评估晚期GC患者的治疗效果和预后；FTO是CSV+CTCs形成和转移的关键调节因子，通过抑制IGF-IR mRNA的降解并促进CSV从细胞质向细胞表面的转移来发挥作用；实施CSV+CTC检测方法为评估复发风险和制定个性化治疗方案提供了新的视角。

总之，这项研究建议使用CSV和EpCAM标志物进行CTCs富集,且强调了Pritumumab（普林木单抗）在抑制GC转移中的作用，表明CSV不仅是CTCs的标志物，也是晚期GC的治疗靶点。

参考文献：

Li H, Zhu YZ, Xu L, et al. Exploring new frontiers: cell surface vimentin as an emerging marker for circulating tumor cells and a promising therapeutic target in advanced gastric Cancer. J Exp Clin Cancer Res. 2024;43(1):129. Published 2024 Apr 30.