泪腺RRBS+RNA-seq揭示Sjögren综合征相关干眼症的潜在基因

Sjögren综合征（Sjögren’s syndrome，SS）相关干眼症是一种以泪腺（lacrimal glands，LGs）慢性炎症为特征的难治性自身免疫性疾病，表观遗传因子在SS相关干眼症发病机制中起着至关重要的作用。然而，泪腺中的DNA甲基化变化及其在SS相关干眼症发病机制中的作用尚不清楚。

近日，天津医科大学眼科医院韦燕凯和孙梅为共同第一作者、魏瑞华教授为通讯作者，在《Journal of Inflammation Research》杂志（发表题为“Integrated DNA Methylation and Transcriptomics Analyses of Lacrimal Glands Identify the Potential Genes Implicated in the Development of Sjögren’s Syndrome-Related Dry Eye”的研究论文，研究对泪腺中的DNA甲基化和RNA测序数据进行综合分析以鉴定SS相关干眼症发病机制中的新型DNA甲基化调控的差异表达基因（MeDEGs）。揭示了SS相关干眼症的表观遗传因子，尤其是DNA甲基化在泪腺（LGs）中的变化及其在疾病发病机制中的作用。

研究方法：

样本选择：雄性非肥胖糖尿病小鼠（NOD / ShiLtJ）vs 年龄匹配的雄性对照BALB/c小鼠。

测序技术：利用简化基因组亚硫酸盐测序（RRBS）和RNA测序（RNA-Seq）技术，分析了不同年龄阶段（4、8、12和16周龄）的SS相关干眼症NOD小鼠泪腺的DNA甲基化和转录组图谱。

关联分析：分析了差异甲基化基因（DMGs）和差异表达基因（DEGs），并进行甲基化水平与mRNA表达的相关性分析。GO和KEGG分析DMGs和DEGs的功能相关性。

验证研究：MSP和qRT-PCR验证关键基因的甲基化和表达水平。免疫荧光染色检测泪腺中CD4+细胞浸润。

研究结果：

RRBS分析结果表明，随着SS相关干眼症的发展，NOD小鼠泪腺中的DNA甲基化水平增加，且主要在GTP酶激活和Ras信号通路中富集。RNA-Seq分析结果表明，与4周正常对照小鼠相比，8、12和16周龄的NOD小鼠分别有1321、2549和3712个DEGs；GO分析揭示DEGs主要富集在T细胞免疫反应中。通过甲基化组和转录组的综合关联分析共鉴定出140个MeDEGs，主要富集在T细胞激活、增殖和分化。基于MeDEGs的GO和KEGG通路分析筛选出8个关键基因，尤其是Itgal、Vav1、Irf4和Icosl这些关键基因，在NOD小鼠SS相关干眼症发病后表达水平升高，并与泪腺中炎症细胞浸润程度呈正相关。免疫荧光分析表明，与对照组小鼠相比，SS相关干眼症小鼠的泪腺中CD4+细胞浸润显著增加。MSP验证结果表明，与对照组相比，SS相关干眼症NOD小鼠中Irf4和Itgal启动子低甲基化。

本研究研究结果揭示了T细胞免疫相关基因的表观遗传调控在SS相关干眼症进展中的关键作用，并表明了DNA甲基化调控基因如Itgal、Vav1、Irf4和Icosl可能作为SS相关干眼症治疗的新靶点。

关键图形：

（1）NOD小鼠在SS相关干眼症发展过程中泪腺的DNA甲基化水平增加

RRBS文库质控、亚硫酸盐转化率和比对率

图1：在NOD小鼠SS相关干眼症发展过程中泪腺的DNA甲基化水平增加。

(A) RRBS技术绘制4、8、12和16周龄NOD小鼠不同阶段SS相关干眼症中CG、CHG和CHH的DNA甲基化率。

 (B) 不同NOD小鼠组泪腺中C位点的基因组覆盖率。

 (C) 单个胞嘧啶的主要成分分析（PCA）。

 (D) CG位点甲基化水平的分层聚类（HC）分析。

 (E) NOD小鼠不同SS相关干眼症阶段泪腺中所有C位点的整体DNA甲基化水平。

 (F) 不同组中CG位点甲基化水平的分布。

 (G) NOD小鼠不同疾病阶段CG位点的甲基化率。

 (H) 所有基因的基因体、转录起始位点（TSS）上游2 kb以及转录结束位点（TES）下游2kb处的DNA甲基化水平。

 (I) 启动子CG岛及其周围区域的DNA甲基化水平。

 (J) 基因功能区域中CG位点甲基化水平热图。红色代表高甲基化；蓝色代表低甲基化。

（2）SS相关干眼症小鼠LG中鉴定的差异甲基化区域相关基因（DMGs）的功能富集

图2：SS相关干眼症小鼠泪腺中鉴定的DMGs功能富集分析。

（A） 8、12和16周龄NOD小鼠与4周龄对照组在CG的DMRs数比较。

 (B-D)  不同阶段SS相关干眼症的不同染色体DMRs比较。

 (E-G)  不同年龄段NOD小鼠组中鉴定的DMRs基因组位点（外显子和启动子）条形图。

 (H)    对DMGs进行GO富集分析。

 (I)     对DMGs进行TOP 10的KEGG通路分析。

 (J-L)   SS相关干眼症发展过程中，qRT-PCR确定泪腺中Dnmt1（J）、Dnmt3a（K）和Dnmt3b（L）变化。每组n=3。

（3）LGs在SS相关干眼症发展过程中的转录组分析

RNA-Seq文库的基本测序质控和图谱率

图3：在SS相关干眼症发展过程中泪腺的转录组分析。

 (A)  所有样本clean reads的比对率。

 (B-C)基于不同组的基因表达进行的主成分分析（PCA）和分层聚类（HC）。

 (D)  每组中差异表达基因（DEGs）热图。

 (E)  三个组中上调DEGs的维恩图。

 (F-H)对重叠上调DEGs的GO富集分析。根据细胞组分（CC）(F)、生物过程（BP）(G) 和分子功能（MF）(H)   对预测基因进行GO分析。

(I) 对DEGs的KEGG通路分析。总结了前20条通路。

（4）DMR与全基因组基因表达的相关性分析

图4：DMRs与全基因组基因表达之间的相关性分析。

（A）甲基化组和转录组综合分析的研究设计图。

（B）
低甲基化 DMR 上调 DEG 的 VENN 分析。

（C -D） 不同 NOD 组中启动子低甲基化上调基因的 GO 和 KEGG 分析。

（5）与SS相关干眼症相关关键DNA甲基化调控基因的鉴定

图5：鉴定与SS相关干眼症相关的主要DNA甲基化调控基因。

 (A) 关键基因筛选流程图。

 (B) 与SS相关干眼症相关的候选功能基因的启动子甲基化水平和表达水平热图。

 (C) qRT-PCR验证泪腺中候选基因的mRNA表达水平。每组n=3。

 (D) 候选基因表达水平与泪腺中淋巴细胞浸润之间的相关性分析。

 (E) 4、8、12和16周龄组泪腺中DAPI和CD4+的免疫荧光标记。

 (F) 候选基因表达水平与泪腺中CD4+细胞浸润程度之间的相关性分析。

 (G) 与对照组4周龄小鼠相比，SS相关干眼症NOD小鼠Icosl（n=3）、Irf4（n=3）、Vav1（n=3）和Itgal（n=3）基因的MSP表征。

易小结

本研究通过RRBS+RNA-seq的综合分析揭示了在NOD小鼠SS相关干眼症的发展过程中，泪腺的基因组DNA甲基化水平增加。NOD小鼠泪腺中上调的Itgal、Icosl、Vav1和Irf4基因与T细胞介导的免疫反应密切相关，可能在SS相关干眼症的发病机制中发挥重要作用。此外，Itgal和Irf4启动子区域的DNA甲基化水平降低，可能是SS相关干眼症中Itgal和Irf4上调的原因。这些发现可以帮助进一步理解SS相关干眼症的病因，并为SS相关干眼症的诊断和治疗提供新的靶点。

参考文献：

SunM, Wei Y, Zhang C, Nian H, Du B, Wei R. Integrated DNA Methylation andTranscriptomics Analyses of Lacrimal Glands Identify the Potential GenesImplicated in the Development of Sjögren's Syndrome-Related Dry Eye. J InflammRes. 2023;16:5697-5714. pii: 440263. doi: 10.2147/JIR.S440263. PubMed PMID:38050559.