细胞培养 | HaCaT人永生化角质形成细胞

HaCaT细胞

正常HaCaT细胞形态图

基本信息

• 细胞名称：HaCaT细胞

• 细胞别称：人类永生化角质形成细胞

• 细胞类型：角质形成细胞、永生化细胞

• 来源：成人皮肤角质形成细胞

• 生长特性：上皮细胞样形态，呈纺锤形外观，具有较强的增殖能力，能够在无血清/低钙条件下生长，适应多种培养基。细胞在培养瓶中生长呈贴壁状态，形成紧密的单层细胞。不具有肿瘤特性。

遗传特性和来源

       HaCaT细胞在p53基因的两个等位基因上都存在突变（这是紫外线辐射诱导的突变的典型特征）[1, 2]。此外，有研究认为HaCaT 细胞的产生与体内p53 抑癌基因突变、衰老基因缺失有关[3]。

       肿瘤抑制基因p53以其在DNA修复中的作用和作为基因组守护者而闻名，可诱导人体皮肤对DNA损伤的反应[4]。由于p53基因体内发生突变，HaCaT 细胞部分丧失了对 DNA 损伤的保护机制，使其容易在培养温度升高的情况下发生细胞遗传学变化。

       HaCaT细胞永生化的另一种机制是端粒酶活性的增加[2]。在正常细胞中，端粒随着每次细胞分裂而不断缩短，直至细胞衰老。端粒酶是一种特殊的细胞酶复合物，具有逆转录酶活性，可维持端粒长度的稳定。相比之下，HaCaT 细胞的端粒酶活性明显增加，从而使端粒长度得到很好的维持。

培养条件和方法

培养条件

培养基：

✳推荐使用：DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培养基+10%胎牛血清（FBS）+1%青霉素-链霉素（Penicillin-Streptomycin）

✳可选用：适合角质形成细胞生长的培养基，如Keratinocyte Serum-Free Medium (KSFM)

培养条件：37℃，5%CO2，95%湿度

培养注意事项

1. 消化时间控制：消化前用PBS缓冲液清洗细胞，确保均匀消化。消化时间需5分钟或更久，但注意避免过度消化

2. 细胞传代密度：传代时细胞密度应适中，通常为1:3到1:6，避免过度生长导致细胞损伤或变形

3. 黑点和碎片：HaCaT细胞内常有黑颗粒，为正常现象。外部少量黑点为细胞碎片，可在换液时用PBS轻轻清洗

4. 细胞漂浮现象：少量漂浮细胞不会影响整体生长，漂浮细胞较多时需通过换液清除

5. 生长速度：传代频率控制，细胞密度达80%时传代，以保持细胞最佳生长状态

传代方法

1. 预热培养基和PBS溶液

2. 细胞消化：去除旧培养基，用PBS清洗细胞2-3次

3. 细胞消化：加入适量0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，室温或37°C孵育2-5分钟，观察细胞从瓶壁上脱落

4. 终止消化：加入含10% FBS的培养基终止消化，轻轻吹打细胞悬液，使细胞分散均匀

5. 收集细胞以150g-250g离心3分钟，去除上清。加入预热的培养基重悬细胞

6. 细胞计数与接种：使用血球计数板计数细胞。按1:3到1:6比例稀释细胞悬液【约(2.5~4.0)×104个活细胞/cm2】，重新接种到新的培养皿中

冻存方法

1. 预先准备好冻存管和冻存保护液（90% FBS + 10% DMSO）

2. 细胞收集：按上述传代步骤消化细胞，并收集到离心管中

3. 150-250g离心3分钟，去除上清

4. 制备冻存细胞悬液：将细胞重悬于预先准备好的冻存保护液中，混匀

5. 分装和冻存：将细胞悬液分装到冻存管中，每管(1.0-2.0)x106个细胞。将冻存管放入程序降温盒中，-80°C过夜。第二天将冻存管转移到液氮中长期保存

复苏方法

1. 水浴预热至37°C，培养基和离心机预热

2. 细胞解冻：将冻存管从液氮中取出，迅速放入37°C水浴中，快速摇晃至液体解冻（不超过2分钟）

3. 细胞离心：将解冻后的细胞悬液转入离心管中，以150g-250g离心3分钟，去除上清

4. 细胞重悬：加入预热的培养基重悬细胞，轻轻混匀后接种到培养瓶中，放入培养箱中培养

5. 观察与记录：复苏后24小时观察细胞状态，确认细胞贴壁和生长情况

培养常见问题及解决方法

细胞贴壁困难

• 确保培养基预热至37°C

• 使用胶原蛋白涂层的培养皿或培养瓶，以提高细胞贴壁能力

• 轻轻吹打细胞悬液，确保细胞均匀分布

细胞增殖速度慢

• 确保培养基中胎牛血清（FBS）的质量和浓度（10%）

• 检查二氧化碳浓度和培养温度是否恒定在5%和37°C

• 检查培养基是否新鲜和正确配制，避免使用长时间储存的培养基

细胞形态异常：如变圆或收缩

• 检查胰蛋白酶消化时间是否过长，适当缩短消化时间

• 确保培养基中的营养成分充足

• 检查培养环境的pH值和渗透压是否适宜

细胞传代时死亡率高

• 避免过度胰蛋白酶消化，使用适量的胰蛋白酶并及时终止消化

• 使用温和的细胞离心速度（150-250g，2-5分钟）

• 传代时避免细胞过度稀释，保持适当的细胞密度

细胞内黑点和碎片多

• 更换新鲜的培养基，避免细胞过度生长导致碎片增加

• 传代时轻轻吹打细胞悬液，避免细胞损伤

培养基中有大量漂浮细胞

• 检查细胞是否过度消化或处理不当，调整操作步骤

• 定期换液清除漂浮细胞，保证贴壁细胞的健康生长

HaCaT细胞的应用

01

角质形成细胞的增殖和分化

也常用作研究表皮稳态病理生理学的模型[5]

02

分析皮肤过敏反应的不同机制、活性氧以及紫外线照射后的影响

03

评估由各种制剂、肿瘤或炎症过程引起的皮肤毒性

04

细胞毒性和体外伤口愈合分析应用

05

永生细胞具有癌前细胞的功能，可以深入了解恶性和肿瘤转化过程中的变化

参考文献：

[1]Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: p53 mutations in human immortalized epithelial cell lines. Carcinogenesis 14:833-839, 1993

[2]Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Mutation hotspots due to sunlight in the p53 gene of nonmelanoma skin cancer. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993

[3]Fusenig NE, Boukamp P. Multiple stages and genetic alterations in immortalization, malignant transformation, and tumor progression of human skin keratinocytes. Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.

[4]Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R, et al. HaCaT cells as a reliable in vitro differentiation model to dissect the inflammatory/repair response of human keratinocytes. Mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.

[5]Harle-Bachor C, Boukamp P: Telomerase activity in the regenerative basal layer of the epidermis in human skin and in immortal and carcinoma-derived skin keratinocytes. Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996

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