项目文章 | 乙烯通过GPCR和MAPK调控影响胶孢炭疽菌中致病基因的表达

2022年6月8日，华东师范大学朱品宽教授为通讯作者，任丹丹为第一作者，在生物2 区杂志Journal of Fungi上发表了题为“Ethylene Promotes Expression of the Appressorium- and Pathogenicity-Related Genes via GPCR- and MAPK-Dependent Manners in Colletotrichum gloeosporioides”的研究文章。文章针对胶孢炭疽菌，乙烯通过GPCR和MAPK进而影响胶孢炭疽菌中致病基因的表达。

研究背景

水果果实在逐渐成熟的过程中，更容易受到微生物的感染；因此应该存在病原体识别水果的成熟状态以调整其感染活动；水果成熟的过程中，主要受到植物激素乙烯（ET）的调控；在果肉中，ET通过协调参与多个生物过程的基因的表达来调节成熟，例如呼吸增加，自催化ET产生，色素积累，质地变化以及整体果实质量性状的积累。与健康水果相比，被感染的水果部位释放的ET含量更高，从而会刺激附近水果的成熟和腐烂。乙烯（ET）代表一种信号，可以被植物病原真菌感知，以加速其孢子萌发和随后的感染。真菌中对ET的反应的分子机制在很大程度上仍不清楚。胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)一种典型的半营养真菌，可以在植物角质层或表皮细胞中存活，直到果实成熟，胶孢炭疽菌表现出明显ET敏感反应，ET会显著影响其孢子萌发和孢子形成。G蛋白偶联受体（GPCRs）是真核生物中最大的一类细胞表面受体，可感知感知环境线索以启动协调生物反应的细胞内G蛋白信号传导；GPCR Pth11还通过检测表面疏水性和植物角质单体来调节表面的形成；这些研究暗示某些GPCR / G蛋白系统可能参与真菌病原体的ET传感。在GPCR/G蛋白系统感知到外源性刺激后，信号可进一步传递到细胞内环磷酸腺苷（cAMP）或丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，这些信号通路是植物病原真菌中建立腺素结构和功能的重要调节因子；细胞内二级信号通路是否参与ET反应以调节腺皮发育是值得研究的。

本研究旨在揭示由ET调节的分子事件，以影响胶孢炭疽菌的发育和致病性。通过转录组分析，系统地探索了与球孢子虫形成和致病性相关的ET调控基因。此外，逆向遗传学研究确定了特异性ET信号传导和响应基因的功能，导致人们推测ET可能通过GPCR和MAPK信号通路促进球孢子虫的形成和致病性。ET在处理后4 h促进编码真菌黑色素生物合成酶、细胞外水解酶和腺皮相关结构蛋白的基因。当发芽持续到24小时时，ET从每个孢子中诱导了多个腺体，但下调了大部分基因。胶孢炭疽菌中的测序报告显示，ET可以引起大量基因的转录变化，这些基因主要负责附胞发育和毒力表达，并且这些过程依赖于GPCR和MAPK途径。

研究思路

该研究通过转录组测序，FDA&PI染色、DAB染色、双荧光染色等技术手段，研究胶孢炭疽菌在收到ET处理之后的转录本表达变化以及对拟南芥侵染之后的生理学表现情况进行检测。并通过同源重组后的真菌转化和基因敲除，研究ET信号响应基因的具体响应机制。

研究结果

1. 乙烯会诱导胶孢炭疽菌分生孢子产生，使其具有更强的感染性

该研究用ET处理的胶孢炭疽的分生孢子在接种后4 h（hpi）的载玻片上显示出71.96%的附着形成率，而对照（CK）值为10.64%。FDA和PI双重染色表明，在24 hpi时，ET处理的样品中PI染色细胞区域的比例较高，Cg-gfp菌株的荧光显微分析表明，ET还可以促进拟南芥叶表面连接部分的附胞形成。此外，通过DAB染色可视化的接种部位活性氧（ROS）的积累表明，ET组中的ROS比CK组强（图1C）。这些结果表明，ET可显著促进孢子的分化和宿主感染。

2. ET会影响孢子中的大量与感染相关的转录本表达

为了揭示与ET对胶孢炭疽菌的影响相关的分子机理，在4和24 hpi下以发芽分生孢子进行了RNA-seq高通量测序。与CK组相比，ET处理在4 hpi下导致833个上调和997个下调基因。PCA显示，CK-4hpi VS CK-24hpi、ET-4hpi VS CK-4hpi和ET-24hpi VS CK-24hpi组间基因表达存在显著差异。对受ET处理影响的差异表达基因（DEGs）进行GO注释和富集分析，进一步发现这些DEG主要编码两种类型的产物：细胞外水解酶和细胞外结构组分。ET处理可以显著促进编码多糖脱乙酰酶，角质酶，多管氧化酶和角质 - 柏拉太宁蛋白的基因的表达。同时，ET还可以促进编码细胞壁蛋白，腺皮结构蛋白，糖脂锚定表面蛋白和其他结构蛋白的基因的转录本水平。

3. ET会在萌发早期诱导疏水性表面结合蛋白A和角质酶相关基因

转录组测序结果筛选ET在4 hpi下诱导的12个最显著的DEG，通过分析其编码的保守结构域相关蛋白，鉴定了编码疏水表面结合蛋白A结构域（HsbA）的三个基因（CGLO_03844，CGLO_00547，CGLO_13252），基于GFP的报告基因分析，表明当该报告基因由HsbA基因的启动子（CGLO_03844和CGLO_13252）驱动时，ET治疗促进了GFP表达信号，这表明这些HsbA基因确实对ET刺激高度敏感；编码C. gloeosporioides的角质酶转录因子基因（CTF1α CGLO_17337，CTF1β CGLO_00958）和角质酶基因（CGLO_17126，CGLO_16577）的基因在ET处理时也显著上调

4. ET促进腺皮细胞壁中的黑色素和脱乙酰甲壳素的积累

胶孢炭疽菌的附胞由ET诱导，具有深色色素的特征性积累，真菌DHN（1，8-二羟基萘）黑色素。真菌转录因子CMR1及其同源物可调节真菌中DHN黑色素生物合成基因的表达；编码C. gloeosporioides黑色素合成酶的基因，包括CgPKS1（CGLO_05047），CgT4HR1（CGLO_10812），CgTHR1（CGLO_00442）和CgSCD1（CGLO_09685），以及转录因子CgCMR1（CGLO_10813），在ET治疗时显着上调。此外，ET还刺激了一组漆酶基因（CGLO_06458，CGLO_02601，CGLO_06095，CGLO_12977，CGLO_02394和CGLO_04100）的转录水平，这些基因可能负责将1，8-DHN单体聚合成最终的黑色素产物。丝状真菌细胞壁通常由甲壳素多糖组成。然而，这种细胞壁成分可以被真菌本身修改用于某些目的，例如逃避宿主免疫识别，从而增强真菌的致病性。甲壳素脱乙酰化酶（CDA）是催化甲壳素转化为壳聚糖的酶。胶孢炭疽菌的基因组包含7个推定的CDA编码基因，其中5个CDA基因（CGLO_07057，CGLO_16772，CGLO_00212，CGLO_16754和CGLO_02140）被ET上调。使用Calcofluor和Eosin Y的双重染色测定显示，随着附睾形成进行的，甲壳素在附原区脱乙酰形成壳聚糖（图5B，表S5）。这些结果表明，胶孢炭疽菌的腺壁以积累黑色素和壳聚糖为特征，其可以通过ET的存在得到高度促进。

5. ET促进腺皮细胞壁中的黑色素和脱乙酰甲壳素的积累

上述研究证实：ET可以促进胶孢炭疽菌的附胞形成和入侵植物细胞，为了进一步筛选伴随的ET诱导基因对ET调节的致病性的贡献。3个选定的ET响应基因被靶向敲除：CgCAP22（CGLO_01483），预测编码appressorium特异性蛋白CAP22的同源物[58];CgCP1（CGLO_12973），编码毒力效应子cerato-plataninCgSCD1（CGLO_09685），编码黑色素生物合成酶。分别进行了菌株培养和感染拟南芥实验，在拟南芥叶的感染测定中，ET处理增强了WT和ΔCgcap22突变孢子接种部位的ROS积累，因此，上调黑色素合成和效应基因对于ET促进胶孢炭疽菌的致病性可能至关重要。

6. ET促进胶孢炭疽菌附着胞形成和毒力增强主要依赖于MAPK和GPCR信号途径

已知丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和G蛋白偶联受体（GPCR）信号通路参与感知环境信号和调节真菌孢子萌发。从C. gloeosporioides的基因组中克隆并鉴定了以下编码MAPK的CgMK1（CGLO_17118），编码MAPKKK的CgSte11（CGLO_15819）以及编码两种GPCR的CgGPCR3-1（CGLO_14522）和CgGPCR3-2（CGLO_16780）。通过原生质体转化和同源重组的敲除突变导致ΔCgmk1、ΔCgste11、ΔCggpcr3-1、Δ Cggpcr3-2和ΔCggpcr3-1/2双突变体的相应突变体。与WT菌株相比，ΔCgmk1和ΔCgste11的生长速率明显受损。ET响应型特征，ΔCgmk1和ΔCgste11突变体在附着胞形成中显示出缺陷，但ET略微促进了孢子萌发。

DAB染色进一步表明，经ET处理后，WT和ΔCggpcr3-1/2接种位点的ROS积累量比相应的对照样品强。相比之下，ΔCgste11接种位点在对照和ET处理条件下导致ROS积累可以忽略不计；这些结果表明MAPK和GPCR介导的信号通路可能参与ET加速的appressorium开发;然而，正是MAPK途径成分是介导ET以促进植物中球孢子菌的致病性所必需的。

结果讨论

乙烯（ET）是促进水果成熟的有效内源激素，而微生物污染导致的水果腐烂会导致更多ET的释放从而进一步加剧水果的腐烂；但ET对植物病原体的这一作用模式和机制在很大程度上是未知的，该研究希望能借助转录组学和反向遗传分析来揭示胶孢炭疽菌对ET的反应机制；胶孢炭疽菌是典型的半活体营养真菌，通过形成附胞感染植物，历史研究表明ET可以加速这种真菌的孢子萌发和随后的附胞发育，该研究发现ET增强了叶片接种部位的附胞发育和ROS积累。表明ET可以通过影响真菌侧来影响病原体 - 宿主相互作用的结果。真菌中的这些ET感知反应，以C. gloeosporioides为例，被认为通过允许病原体准确地将其感染时间定在宿主的成熟阶段，为病原体提供了适应性优势。

本文研究结果显示了ET可以改变与加速孢子萌发，腺皮形成和C. gloeosporioides的毒力表达密切相关的基因的转录本水平。此外，促进球孢子虫的基因表达、形态发生和致病性的ET似乎依赖于GPCR和MAPK途径，尽管真菌中ET信号的上游感知机制仍然模糊不清。这些发现与植物病原真菌可以通过与植物不同的途径对ET作出反应的假设非常吻合因此，有可能选择性地阻断真菌病原体中的ET感知，以便在果实成熟期间进行疾病管理，尽管实现这一目标应基于充分了解未来真菌中确切的ET传感和信号传导机制。