基于双端原位测序的亚细胞分辨率新型空间多组学技术-MiP-seq

在单细胞水平解析组织空间异质性及其分子空间表达模式的空间组学是生命科学研究的关键前沿技术，其多组学拓展广度与高通量检测深度已为各研究领域的热点问题带来了新的发现与见解。目前空间组学按照技术路线可分为基于测序(Sequencing-based spatial transcriptomics，sST)捕获和基于成像(imaging-based spatial transcriptomics，iST)两大类。基于NGS的空间组学方法可进行全转录组范围内的捕获，且部分方法可拓展至多组学，但缺乏真正的单细胞分辨率，而且检测效率较低、成本较高、批间差异较大；基于成像的空间组学方法具有亚细胞分辨率，且捕获效率高，部分方法兼容多组学，但大多数方法为靶向空间组，全转录组模式下捕获效率较低，多轮成像光毒性大，高密度信号解析困难。

2024年5月14日，鲲羽生物核心研发团队在国际著名学术期刊《Nature Biomedical Engineering》杂志在线发表了题为“Spatial multi-omics at subcellular resolution via high-throughput in situ pairwise sequencing”的研究论文，开发一种基于成像的新型空间组学技术——多组学双端原位测序技术（multi-omics in situ pairwise sequencing, MiP-seq），能够在亚细胞分辨率下同时高效地解析多重DNA、RNA、蛋白质和功能小分子，展示了其在空间多组学分析中的巨大应用潜力。

小编在此以MiP-seq主要技术创新与应用扩展几个方面进行文章解读：

一、双条形码锁式探针与双端测序策略

MiP-seq采用双条形码锁式探针设计和双端测序策略。与传统的单条形码锁式探针和单端测序策略相比，双条形码编码策略能够在每个轮次内对十种不同的组合进行编码，增加了信号解码能力。以少轮次实现高通量的方式，使得测序和成像成本大幅降低，同时显著缩短成像时间，从而最大限度减少光毒性。

二、探针设计策略及生化反应体系的优化  

与传统的原位测序方法相比，MiP-seq显著提高了原位测序检测效率。通过与smFISH的HCR3.0进行比较，对特定基因的检测效率可高达96%。同时，基于高效的检测效率和独特的探针设计，MiP-seq可以实现在DNA 和 RNA水平的单碱基突变原位检测，并进一步可以区分RNA水平上的 m6A修饰。基于 MiP-seq的高通量和单碱基分辨率，解析了小鼠海马区中亲代基因的等位基因空间特异性表达模式。

图1. MiP-seq的技术原理及流程示意图

三、单细胞分辨率空间图谱绘制 

通过MiP-seq技术，团队人员绘制了小鼠下丘脑斜角带水平支（HDB）中100个基因的空间表达图谱，这些基因包括与神经递质相关的基因、神经元标记基因以及神经元活动标记基因。同时基于MiP-seq研究了小鼠下丘脑室旁核（PVN）响应外周结核分枝杆菌（M.tb）感染的空间转录组变化，解码了217个基因的空间转录组图谱，并在各种细胞类型中确定了对感染反应的上调和下调基因。MiP-seq为实用、高效、高清的空间转录组图谱绘制提供了新的解决方案。

图2. 小鼠HDB核团100个基因单细胞分辨率空间图谱的绘制

四、大视野与3D结构下基因空间表达构筑

基于MiP-seq，团队人员成功绘制了小鼠大脑整个矢状面中多基因的空间表达图谱，实现了大视野下全脑范围内的成像图谱绘制；同时，对来自整个小脑的多张间隔切片进行了多重基因检测，以重构模拟的方式展示了3D结构下多基因在整个小脑中的表达和分布情况。此外，直接在完整斑马鱼端脑中通过MiP-seq解析了多基因的表达与位置信息，实现真正3D结构下分子空间构筑。

图3. 大视野与3D结构下脑组织基因表达谱空间构筑

五、空间多组学的扩展应用 

MiP-seq不仅可以针对转录组水平，还可以扩展至其他组学水平（基因组、蛋白组等），实现空间多组学图谱的绘制。MiP-seq通过抗体-核酸偶联的方式，将抗体信息与蛋白质、神经递质等分子信息转换成barcode序列信息，从而实现在亚细胞分辨率下同一个细胞里DNA、RNA和蛋白质的共同检测，以绘制多组学层次的生物分子空间景观。

图4. 应用MiP-seq解析弥漫性大B淋巴瘤组织样本中30种蛋白及6种mRNA的空间分布

六、多种功能成像技术的兼容 

MiP-seq能够与拉曼成像和活体Ca2+成像等多种功能成像技术兼容，在空间多维层次分析上具有巨大的应用潜力，特别是具有多维信息的组织图谱解析，以及对细胞表达谱与分子功能的关联解析方面。团队人员通过MiP-seq技术与活体Ca2+成像联合使用，获得了小鼠视觉皮层中神经元的基因表达与功能活动关联信息。

图5. MiP-seq技术与活体Ca2+成像与拉曼成像技术兼容

七、稀释策略解决光信号拥挤

光信号拥挤是几乎所有基于成像空间组学方法都会面临的“头疼”问题。MiP-seq提出了一种序列稀释策略，通过使用一组测序引物和锚定基因引物来进行信号的稀释分批解读，从而解决信号拥挤问题，以时间换空间，提高了高密度信号的解析准确性。

图6. 用于解决光学拥挤信号的稀释策略

总之，MiP-seq技术为生物学研究和医学领域带来了新的解决方案，该方法在捕获策略、解码通量、靶标检测范围、高密度成像、SNV、RNA修饰、功能成像整合分析等多方面进行了优化与扩展。相较于传统的空间组学方法，MiP-seq具有独特的技术优势和扩展应用，在靶向空间多组学领域具有重要的应用价值和前景。这种高效的空间多组学方法将为发育生物学、脑科学、免疫学、肿瘤学、微生物学等领域提供更精准的高空间分辨率多维空间图谱。通过以生物大分子的原位实景还原方式来解析细胞结构和功能，有望推动对生物系统复杂性的理解和疾病机制的探索，为研究人员提供更全面的信息。

在这个新兴的研究领域，基于MiP-seq技术将进一步结合超分辨低毒成像系统，以期实现长读长测序策略，能够全面捕获全基因组和全转录组的信息，以及与空间代谢组的整合分析，以此获得组织和器官详细全面的分子和功能图谱多维重建。

全文链接：

https://www.nature.com/articles/s41551-024-01205-7#citeas