项目文章Bone Research(IF12.7) | 转录组测序和单细胞测序助力解析韧带骨化的细胞和分子特征

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同济大学医学院医学院罗剑教授与上海长征医院杨莉莉教授合作在Bone Research上在线发表了题为“Sorafenib inhibits ossification of the posterior longitudinal ligament by blocking LOXL2-mediated vascularization”的研究成果，研究阐明了后纵韧带骨化（OPLL）过程中LOXL2 在韧带细胞内皮样分化中的作用，并证实了索拉非尼对OPLL的治疗干预潜力。该研究中转录组测序和数据分析服务由元莘生物提供。

后纵韧带骨化 （OPLL） 是一种退行性骨质增生病，其特征是软韧带和弹性椎韧带转化为骨骼，导致脊柱活动受限和神经压迫。研究采用bulk RNA和scRNA测序获得基础研  究数据，在单细胞分辨率上阐明了OPLL演化过程中的细胞和分子特征，并在临床样本中验证了这些发现。这项研究揭示了韧带干细胞在体外和体内表现出内皮细胞样表型的能力。研究将LOXL2确定为OPLL演化过程中的关键调节因子。通过功能获得和丧失研究，研究阐明了 LOXL2 在韧带细胞内皮样分化中的作用：LOXL2通过HIF1A通路起作用，促进下游VEGFA和PDGF-BB的分泌，进而调控韧带细胞的内皮样分化。此外，研究发现索拉非尼（广谱酪氨酸激酶抑制剂）可以有效抑制LOXL2介导的血管形态发生。通过破坏血管形成和成骨之间的偶联，索拉非尼在BMP诱导和enpp1缺陷诱导的动物模型中均显示出对OPLL进展的显著抑制，同时对正常骨量没有明显影响。这些发现强调了索拉非尼作为OPLL治疗干预措施的潜力。

转录组数据解析骨化组中的转录组调控路径：研究对4名OPLL患者的韧带样本进行RNA-seq分析，研究对从骨化 （OPLL） 和副骨化 （non-OPLL） 韧带样本中获得的转录组测序数据的分析揭示了与骨化组织中血管生成和血管生成相关的基因和信号通路的上调。随后的功能丧失和获得实验，提供了LOXL2 通过 HIF1A 信号通路调节韧带细胞分化为内皮样细胞的证据。研究发现索拉非尼是一种小分子抑制剂，可以抵消 LOXL2 上调导致的增强的内皮样分化和成骨。重要的是，通过证明索拉非尼对各种啮齿动物模型中骨化进展的抑制作用，我们的研究结果得到了进一步证实。

单细胞测序揭示韧带细胞内皮分化轨迹，对3例退行性颈椎病患者的后纵韧带（OPLL）和2例无骨化（non-OPLL）的患者进行了scRNA-seq分析，获得51245个细胞转录本数据，注释得到的一簇骨化韧带细胞，具有骨相关基因（BGLAP、RUNX2、SP7）的高表达)36和祖细胞特征基因PRG4，PRG4细胞是异位骨化的干细胞，通过对患者组织切片，结果显示PRG4在骨化和非骨化连接区域表达显著升高。OPLL中韧带细胞的特征和细胞层次结构，进行RNA速率分析并构建了韧带细胞分化为血管的演化轨迹。

LOXL2通过HIF1A通路调节韧带细胞内皮分化：LOXL2 过表达后毛血管结构的形成增加，BAPN（抑制胶原蛋白赖氨酸残基催化氧化）处理不会影响韧带细胞中管状结构的形成；转录组测序结果显示骨化韧带组织中缺氧和血管生成通路上调；转录因子HIF1A是缺氧信号传导的主要调节因子，观察到 LOXL2 （OE-LOXL2） 过表达后韧带细胞中 HIF1A 的显著上调，LOXL2 的过表达导致 HIF1A 及其下游基因 VEGFA-C 和 PDGFB 的表达增加。LOXL2通过调节HIF1A信号通路影响韧带细胞的内皮分化。LOXL2通过HIF1A / VEGFA途径调节血管形成。

索拉非尼减弱BMP诱导的骨化发展：VEGFA单克隆抗体和VEGFR抑制剂索拉非尼对LOXL2诱导的韧带细胞血管形成的影响，研究结果表明：索拉非尼作为多靶点酪氨酸激酶抑制剂可同时抑制VEGFR和PDGFR，进而对骨化进程有显著抑制作用。索拉非尼引起的血管形成和成骨的解耦会阻碍骨化的进展。