CRISPR/Cas9脱靶分析

1     总体思路

        由于CRISPR/Cas9编辑系统的脱靶常表现为在错配位点引入小片段的插入、缺失或碱基替换，即SNP位点与indel。因此使用SNP分析软件，分析编辑菌株相较于出发菌株的全基因组SNP与indel，并与潜在脱靶位点进行比较，即可初步检测编辑菌株在潜在脱靶位点是否发生脱靶。

 2     潜在脱靶位点预测

       使用Cas-OFFinder（http://www.rgenome.net/cas-offinder/）在线预测网站，选定PAM type 为SpCas9 fromStreptococcus pyogenes:5'-NGG-3'，在Query Sequences 中 填入20 bp 靶位点序列，Mismatch Number设置为5、DNA Bulge Size和RNA Bulge Size均设为0 （也可根据需要放宽阈值，将Mismatch Number、DNA Bulge Size和RNA Bulge Size数值调高），Target Genome、Organism Type选定为others、选择Genomes 为Escherichia coli K-12 MG1655，点击submit。也可下载本地版Cas-OFFinder 进行分析。打开snps.txt 结果如下：

#Bulge type   crRNA   DNA    ChromosomePosition   Direction    MismatchesBulge Size

XTTGCCCTGCTGCTACAAAACNGG   TcttCCTGaTGCTACcAAACTGG    chr8   5020960  -5  0

XTTGCCCTGCTGCTACAAAACNGG   TTtCCtTaCTGCTACAAAcaCGG    chr8   6972501  -5  0

XTTGCCCTGCTGCTACAAAACNGG    TTtCCtTaCTGCTACAAAtaCGG    chr8   7010764  -5  0

XTTGCCCTGCTGCTACAAAACNGG    TTtCCtTaCTGCTACAAAtaCGG    chr8   6991661  -5  0

         预测结果有潜在脱靶序列（小写字母为错配碱基），在基因组位置，错配碱基数目和凸起数目。

3     全基因组snp分析

       Snippy 软件可用来查找单倍体参考基因组和 NGS 序列读数之间的SNP 和插入/缺失 （indel），一行命令行即可搞定：

      (snippy):  snippy --reference  出发菌株.fasta --ctgs  编辑株.fasta   --cpus 10   --outdir  SNPS 

--reference      fasta 格式的参考基因组

--ctgs               fasta 格式的编辑株基因组

--cpus              运算使用的cpu 数目

--outdir           运算结果输出文件夹名称

       打开 snps.txt 文件，看到文件格式如下，重点关注位置序号pos

4  结果分析

       将2 中分析出的每一个潜在脱靶位点与3 中snp 为位点比对, 若snp位点处于潜在脱靶位点位置序号±20bp 的范围，进一步进行序列比对，查看是否脱靶。若snp位点处于潜在脱靶位点位置序号±20bp 的范围之外，则可初步判定该位点未发生脱靶。    

       以上是我脱靶分析的初步尝试，欢迎大家批评指正，一起交流。