Joakim Lundeberg及其代表作

来自皇家理工学院基因科技系，生命科学实验室的Joakim Lundeberg团队（Visium芯片开发者）开发出了空间多组学新策略，该方法合并了组织学、质谱成像及空间转录组来精准检测跨组织区域的转录组及低分子量代谢组的空间信息。此工作流程能与商业化的Visium芯片兼容。并在鼠脑及人脑组织的帕金森疾病样本中完成测试。

空间分辨率的转录组能提供全基因组尺度的mRNA表达及位置信息，空间转录组方法不尽相同，各种方法均能产生具有组织坐标的基因表达矩阵。质谱成像（MSI）则是一种无须标记，能直接对新鲜组织切片的生物分子丰度进行空间分辨率的测量。基质辅助激光解吸/电离MALDI-MSI是一种将基质喷洒在组织表面的质谱成像方法。虽然空间转录组及质谱成像技术已广泛应用于空间生物学中，但由于实验限制，此两种方法仍是分开使用的。本研究则展示了同一张组织切片上进行空间转录组（SRT）及空间代谢组（MALDI-MSI）的多模式分析，且依旧保留极高的灵敏性及特异性。

图1 多模态空间组学方法研究代谢物、形态和基因表达分析

方法的建立

此工作流程主要分为4步：

1、将速冻组织切片贴在不带电荷的条形码阵列芯片上。

2、进行MALDI-MSI。

3、苏木精和伊红(H&E)染色，明场显微镜成像。

4、进行SRT。此流程无需修改商业化的Visium芯片，也无需修改MALDI-MSI步骤，除了在倒数第二步用预冷的甲醇洗涤芯片。

为了验证本方法的可行性，用包埋polydT 探针的玻片评估MALDI-MSI后的组织切片中RNA的降解程度。制备小鼠大脑的冠状切片，并喷洒四种不同的MALDI基质分别检测对应代谢物，MALDI MSI成像，室温下收集光谱。在组织优化实验中对cDNA进行荧光显微镜成像，表明了捕获的转录本与组织形态相关性良好，令人惊奇的是在所有基质中进行MALDI MSI成像后mRNA依旧保存较好。

方法重复性验证

进一步对本方法的重复度验证。用带条形码的Visium寡链玻片进行重复实验，通过测序对捕获的转录本进行定量。应用来自三只小鼠的7张连续冠状切面进行3种不同MALDI基质成像。分别对比了对应组织切片的MALDI MSI及基因表达数据，数据表明小分子与基因表达谱相关性良好。与独立MALDI-MSI或Visium实验相比，61.6-98.2%的分子的表达量变化在0.5倍以下，这对于下游的生物学分析及分子鉴定没有明显的影响。对转录组学数据的联合分析和可视化显示在不同实验条件下基因表达整合良好，Marker基因表达相似，空间类群高度保守。这些结果进一步说明了本方法可以与多种基质一起同时进行基因表达和生物分子空间分析。

图2 空间多模式分析帕金森疾病小鼠模式和人帕金森疾病死后样本

本方法在小鼠帕金森疾病模型中的适用性验证

为进一步验证本方法的适用性，在帕金森小鼠模型中进行了进一步实验。帕金森是一种神经退行性疾病，其主要特征为黑质致密部（SNc）内多巴胺能神经元的丧失，该神经元包含投射到纹状体背壳核的神经元。本研究在3例单侧6-羟基多巴胺(6-OHDA)损伤小鼠的SNC和纹状体脑区中同时捕获了基因表达及相关的神经递质。他们在单侧完整的脑区中检测到了多巴胺，而损伤一侧则未检测到。本方法产生的多模态数据也被用来鉴定与多巴胺表达相关的基因的表达。不出所料的，关键的多巴胺通路相关基因Th, Slc6a3, Slc18a2及Ddc与SNc与多巴胺表达相关。同样的，在纹状体切片中多巴胺的水平也与与Pcp4、Tac1等基因表达呈正相关，与Penk、Cartpt等基因表达负相关，这提示中棘神经元失调，这也与以往的发现一致。此外，本方法确定了多种神经递质和代谢物的定位，如牛磺酸、3-甲氧基酪胺、3,4-二羟基苯乙醛(DOPAL)、3,4-二羟基苯乙酸、去甲肾上腺素、血清素、组氨酸、生育酚和γ -氨基丁酸。结果表明，分子的空间分布与以前单独使用MALDI-MSI的大鼠模型相似。

本方法在人帕金森疾病中的适用性验证

为进一步的证明这种多模途径在人的样本中的相关性，他们在2.4 × 0.5 cm 的帕金森疾病死后纹状体脑组织切片中测量了神经递质及基因表达。为了解决和克服死后材料中的RNA降解问题，采用了最新方案用于从低/中等RNA质量的新鲜冷冻组织样本中进行基因表达测量。多巴胺和3-甲氧基酪胺的MSI空间分布证实了之前的发现，这些神经递质在腹侧尾状核内侧分裂中观察到较高的水平。多模式相关性分析中SCG2转录本与多巴胺的丰度相关性极高。使用人类样本尾状核的公开snRNAseq数据进行细胞类型反卷积分析，其中包含6个MSN神经元簇，这些结果均与本研究帕金森疾病样本中的发现一致，MSN.D1b神经元富集在多巴胺表达区域，与SCG2的空间表达模式类似。

总结

总的来说，他们建立了一种在同一张组织切片中进行小分子空间图谱及基因表达分析的空间多组学方法。本方法有望在固定样本或其它模式如标记抗体上进行拓展应用。本技术的影响也可能扩展到其他学科中，例如肿瘤学。本方法能为肿瘤研究提供一些新见解，例如在调节肿瘤微环境和驱动治疗反应过程中的动态交互。基因表达也可以用于来推断基因组的完整性，这对于匹配肿瘤克隆及药物治疗非常重要。本方法提供了更高水平的多模式分析来研究组织环境中的小分子。