Aging Cell/IF8：卵巢发育和衰老的m6A 甲基化揭示RNA稳定性和染色质状态调控

图1：在人卵巢不同阶段的转录组m6A的整体差异分析。

(a)  人卵巢动态微观结构和m6A MeRIP-seq测序示意图。

(b)  人卵巢匹配样本间m6A水平的皮尔逊相关热图。

(c)  在人卵巢不同阶段富集的m6A峰值和基因数量。

(d)  在卵巢发育（OD，从胎儿期到年轻期）、卵巢功能下降（OFD，从年轻期到老年期）和卵巢衰老（OA，从老年期到绝经期）期间获得和丢失m6A的基因数量。

(e)  在OD、OFD和OA期间获得和丢失的m6A峰值数量。

(f)  OD、OFD和OA期间m6A基因表达水平箱线图。

(g)  OD、OFD和OA期间mRNA表达水平的箱线图。

(h)  OD、OFD和OA期间重叠的m6A和mRNA水平的系数相关性分析。

(i)  OD、OFD和OA阶段差异表达的m6A基因的维恩图（p<0.05）。 (j)  OD、OFD和OA阶段比较207个基因的m6A和mRNA水平。 (k)  模糊C均值聚类鉴定了m6A基因的四种不同的时间模式。x轴代表四个阶段，而y轴代表每个阶段的log2转换、标准化强度比率。 

图2：在四个不同阶段的逆转录病毒RNA的m6A甲基化和转录组分析概况。

(a, b) 在胎儿期（Fet）、年轻期（Yng）、老年期（Old）和绝经期（Mop）中，逆转录病毒RNA的m6A和转录组的表达水平。

(c) 人卵巢匹配样本之间逆转录病毒RNA的m6A水平的皮尔逊相关热图。

(d) 在四个组中，带有m6A修饰的不同类型逆转录病毒RNA的百分比。

(e) 相邻阶段之间带有和不带有m6A修饰的逆转录病毒RNA的维恩图。

(f) 在卵巢发育（OD）、卵巢功能下降（OFD）和卵巢衰老（OA）期间，常见逆转录病毒与m6A和RNA表达水平之间的相关性分析。

(g) 在OD、OFD和OA期间逆转录病毒中m6A和RNA表达水平的箱线图。

(h) 在胎儿期、年轻期、老年期和绝经期中，ERV1、ERVL-MaLR和ERVL的m6A RIP和input信号的平均概况。

图3：FTO基因敲除（FTO-KO）影响卵母细胞（卵泡）发育潜力。

(a–c) 来自FTO-KO和野生型（WT）小鼠的GV期和MII期卵母细胞的数量。

(d)
FTO-KO和WT卵母细胞中γ-H2AX（红色）和FTO（绿色）的染色图像。

(e)
FTO-KO和WT卵母细胞中每个卵母细胞的γ-H2AX焦点数量（***p<0.001）。 (f) FTO-KO和WT卵母细胞中染色体（红色）和纺锤体（绿色）的染色图像。 (g) FTO-KO和WT卵母细胞中纺锤体和染色体缺陷的百分比（***p<0.001）。 (h) FTO-KO和WT小鼠的卵巢大小。 (i) FTO-KO和WT小鼠卵巢重量与体重的比例（***p<0.001）。 (j) FTO-KO和WT卵巢的HE染色（比例尺，500微米）。 (k, l) FTO-KO和WT组中FTO（红色）、VASA（绿色）和GDF9（绿色）的相对荧光素酶活性（***p<0.001）。

图4：FTO基因敲除（FTO-KO）介导细胞凋亡并影响逆转录病毒RNA m6A水平。

(a) 六月龄FTO-KO和野生型（WT）小鼠卵巢中总RNA样本的m6A斑点印迹。

(b)  FTO-KO和WT小鼠之间m6A修饰基因的维恩图。

(c)  FTO-KO组与WT小鼠相比的特异性m6A修饰基因皮尔逊相关性热图。

(d)  FTO-KO和WT小鼠中4232个重叠基因在启动子区域的m6A信号强度。

(e)  FTO-KO和WT小鼠中4232个重叠基因的mRNA表达水平的箱线图。

(f) 火山图显示FTOKO和WT小鼠中差异表达的m6A基因。x轴代表log2转换的倍数变化，而y轴代表log10标准化的p值。

(g)  312个差异表达的m6A修饰基因的GO分析。

(h, i)  在Wnt和凋亡信号通路中m6A和mRNA水平的皮尔逊相关系数。

(j, k)  FTO-KO和WT小鼠中切割Caspase 9和Bad的蛋白表达（*p<0.05, ***p<0.001）。 (l)  FTO-KO和WT小鼠中ERV1的m6A RIP和input信号的平均概况。

图5：FTO基因敲低（FTO-KD）在卵巢衰老期间影响了SUV39H1-H3K9me3-ERV轴。

(a, b) FTO-KD和空载体（EV）KGN细胞系中FTO蛋白的表达（***p<0.001）。 (c, d) FTO-KD和EV组新合成RNA的荧光素酶强度信号（***p<0.001）。 (e) FTO-KD和EV组中m6A修饰基因的皮尔逊相关性热图。 (f) FTO-KD和EV组中差异表达的m6A基因散点图。 (g) FTO-KD和EV组中差异表达的m6A修饰基因的GO分析。 (h, i)  FTO-KD和EV KGN细胞系中H3K9me3蛋白的表达（*p<0.05）。 (j) FTO-KD和EV组中差异TEs上的H3K9me3信号的平均值。 (k) FTO-KD和EV组中增加和减少的TEs上的H3K9me3信号。 (l) FTO-KD和EV组中增加的ERVK、ERV1和ERVL上的H3K9me3信号的平均值。EV，empty vector。

图6：METTL16过表达在卵巢衰老中调控SUV39H1-H3K9me3-ERVs轴。

(a, b) M16-OE和EV
KGN细胞系中METTL16蛋白的表达（***p < 0.001）。 (c, d) M16-OE和EV组新合成RNA的荧光素酶强度信号（***p < 0.001）。 (e) M16-OE和EV组中m6A修饰基因的皮尔逊相关性热图。 (f) M16-OE和WT组中差异表达的m6A基因散点图。 (g) M16-OE和EV组中差异表达的m6A修饰基因的GO分析。 (h, i) M16-OE和EV KGN细胞系中H3K9me3蛋白的表达（**p < 0.01）。 (j) M16-OE和EV组中差异TEs上的H3K9me3信号的平均值。 (k) M16-OE和EV组中增加和减少的TEs上的H3K9me3信号。 (l) M16-OE和EV组中增加的ERVK、ERV1和ERVL上的H3K9me3信号的平均值。

图7：由m6A高甲基化诱导的ERV1激活是卵巢衰老的诱导因子。

(a) FTO-KD和M16-OE组中差异表达的m6A修饰基因（p<0.05）的维恩图分析。 (b) FTO-KD组中前三大m6A motif。 (c) FTO-KD和M16-OE组在不同基因组区域共有m6A峰值比例。 (d) M16-OE和FTO-KD细胞系中共有增加的TEs上的H3K9me3信号平均值。 (e) M16-OE和FTO-KD细胞系中共有减少的TEs上的H3K9me3信号平均值。 (f) FTO-KD组中差异表达的TEs的散点图。 (g) FTO-KD组中表达变化的七个ERV1亚家族，其FC>2。

(h,i) sgLTR12和sgLTR7细胞中增殖标记KI67的免疫荧光染色（***p<0.001）。 (j,k) sgLTR12和sgLTR7细胞中衰老标记SA-β-gal的染色结果（***p<0.001）。 (l,m) sgLTR12和sgLTR7细胞中衰老蛋白p21和p53的表达（*p<0.05, **p<0.01）。