Base Edit：精准且能够高效实现单碱基替换的技术

传统的CRISPR/Cas9技术通过在靶点处产生DNA双链断裂(DSB)，从而诱发细胞内的同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)修复途径，进而实现对基因组DNA的定点敲除、替换、插入等修饰。然而，DSB引发的DNA修复很难实现高效稳定的单碱基突变。
基于CRISPR/Cas9 系统开发的碱基编辑技术 (Base editing) 通过将失去切割活性的核酸酶与不同碱基脱氨基酶融合，构建了两套碱基编辑系统 (Base editors，BE)：胞嘧啶碱基编辑器 (Cytosine base editor，CBE) 和腺嘌呤碱基编辑器 (Adenine base ditor，ABE)。这两类编辑器分别能够在不产生DNA 双链断裂的前提下在基因靶位点完成C>T (G>A) 或A>G (T>C) 的替换，最终实现精准的碱基编辑。
目前碱基编辑技术已经广泛应用于基因治疗、动物模型构建、精准动物育种和基因功能分析等领域，为基础和应用研究提供了强大的技术工具。

David Liu实验室开发了三种不同的碱基编辑器

胞嘧啶碱基编辑器(CBE)
腺嘌呤碱基编辑器(ABE)
先导编辑器(Prime Editor)

这些碱基编辑器在工作时不依赖DSB的产生，也不需要供体DNA的参与。

BE1是基础编辑器的原始版本，由催化失活形式的Cas9（dCas9）和rAPOBEC1组成。
以A、B表示DNA的两条链；
记PAM-NGG所在的序列为A链；
记A链互补的链为B链；

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PAM位点上游20nt序列，即是sgRNA的spacer序列（A）
与sgRNA杂交的链称为编辑链，即B，作用的区域为HNH H840;
A链称为非编辑链，作用的区域为RuvC D10
RuvC区域：
HNH结构：切割与sgRNA互补的区域
RuvC和HNH结构域发挥核酸内切酶的功能

There are two kinds of Cas9 nickases, nCas9(D10A) and nCas9(H840A), which respectively produce cleavage of the complementary and non-complementary strand.

Schematic-representation-of-Cas9-from-Streptococcus-pyogenes-SpyCas9-used-for.png

第一代胞嘧啶碱基编辑器：rAPOBEC1-XTEN-dCas9

第二代胞嘧啶碱基编辑器：rAPOBEC1-XTEN-dCas9-UGI

第三代胞嘧啶碱基编辑器：rAPOBEC1-XTEN-nCas9-UGI

为了进一步提高编辑效率，David Liu实验室结合细胞的内源修复机制开发了第三代碱基编辑器BE3。BE3将BE2中的dCas9替换为nCas9(D10A)，可特异性地在非编辑链上产生一个缺口，进而刺激细胞内的碱基错配修复途径(MMR)，以含有U的编辑链作为模板进行修复，从而增加编辑效率。BE3的编辑效率比BE2提高了2~6倍，平均约为37%，该碱基编辑器是目前较为广泛使用的CBE版本。
nCas9(D10A)：括号内为突变的位点，即保留了非编辑链HNH区域的切割活性，切割sgRNA互补配对的一条链。非PAM所在链。

BE3 enables direct and irreversible conversions of cytosine (C) to uracil (U) or thymine (T) at positions 4–8 (counting from the distal side of PAM) of the noncomplementary strand of DNA, and induces far fewer unwanted indels or translocations.

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第三代胞嘧啶碱基编辑器的不同子版本

BE3编辑的活性窗口可覆盖sgRNA的第4~8位，依据不同的研究目的需要对编辑活性窗口做相应的改变。当需要精准地改变某个特定的碱基C时，过大的活性窗口会导致窗口内非靶标碱基C的编辑。David Liu实验室在BE3的基础上，通过突变胞嘧啶脱氨酶上与DNA作用的关键活性位点，开发了YE1-BE3、YE2-BE3、EE-BE3和YEE-BE3，从而将编辑活性窗口由5nt缩小至1~2nt，但同时对靶标C的编辑效率有所降低。

第四代胞嘧啶碱基编辑器：rAPOBEC1-XTEN-nCas9-2UGI

BE3编辑后依旧会产生不同的产物，主要表现为两个方面: (1) BE3除了将C转换为T之外，也有一定几率将C转换为G或A。这是由于UDG可将U切除形成无嘧啶位点(AP)，经过跨损伤合成(TLS)聚合酶作用及DNA复制等，也有一定几率将C转换为其他碱基。(2) 在编辑过程中会产生少量的Indels ，这是由于形成的AP位点会在AP裂解酶或自发裂解下产生一个缺口，进而与nCas9在非编辑链产生的缺口刚好形成一个DSB，经过NHEJ修复途径后产生Indels产物。

为了减少不必要的编辑产物，David Liu实验室在BE3的基础上融合了第二个拷贝的UGI，增强对UDG的抑制作用，构建了第四代胞嘧啶碱基编辑器BE4。与BE3相比，BE4不仅提高了碱基编辑效率，并且C至A或G的转换频率降低了2.3倍。

第四代胞嘧啶碱基编辑器的不同子版本

为了降低Indels的发生，David Liu实验室在BE4的基础上融合了来源于噬菌体Mu的Gam蛋白，构建了BE4-Gam。Gam蛋白可结合于DSB的末端防止其降解，进而阻止了NHEJ修复途径的发生。

细胞内胞嘧啶碱基编辑器的表达水平是影响其编辑效率的重要因素，David Liu实验室在BE4的基础上通过增加不同数量的核定位信号(NLS)以及使用不同公司优化的密码子序列等方法构建了BE4max和AncBE4max，这两种胞嘧啶碱基编辑器可在各种哺乳动物细胞内进行高效的编辑。

腺嘌呤碱基编辑器

由于目前已知的腺嘌呤脱氨酶不能以DNA为底物对碱基A进行脱氨，因此必须对现有的腺嘌呤脱氨酶进行定向改造，这导致ABE的开发比CBE更具有挑战性。David Liu实验室选取大肠杆菌的腺嘌呤脱氨酶TadA为改造对象，将随机突变的TadA融合dCas9构建随机突变库，通过ABE恢复氯霉素、卡那霉素、壮观霉素等抗性基因的功能，结合易错PCR、DNA重排等定向进化策略，进行相应的抗生素筛选，先后经过7轮进化与改造后，成功筛选到了能直接作用于ssDNA的腺嘌呤脱氨酶，在人类细胞中建立了目前效率最高且应用最广的ABE版本ABE7.10(ecTadA-ecTadA*-nCas9)

ABE7.10将nCas9与野生型腺嘌呤脱氨酶ecTadA和经过定向进化的腺嘌呤脱氨酶ecTadA*二聚体融合，在人类细胞中编辑效率约为50%，编辑活性窗口可覆盖sgRNA的第4~9位。

HNH结构域负责剪切的是与crRNA互补的那条链，RuvC结构域剪切的是另外一条链。

碱基编辑器到底是个什么“神器”，为什么所有人都想用它？