鲲羽科普|浅谈Image-based空间组学中的“摩斯密码”

如今空间组学技术快速发展，被越来越多的研究领域和场景广泛应用。基于下一代测序（NGS-based）和基于成像（Image-based）两种方式的各类空间组学技术平台不断涌现，此两种方式由于底层技术逻辑不同，对基因的标记与结果解读方式也存在很大差异。

 基于成像方式的空间组学实现了真正的“眼见为实”，能够在组织原位水平中直接呈现基因信息。与NGS-based的空间组学技术将测序得到的数据注册到原始样本的空间信息相比，基于成像方式的空间组学技术具有更高的空间真实分辨率和检测效率。然而，由于Image-based技术平台依赖荧光探针标记与荧光显微镜采集，荧光标记的数量和荧光通道的限制使得在有限信号条件下实现对成千上万个基因的解析成为一项重要挑战。为获得高通量的原位信号输出，各种信号编码方法应运而生。今天就给大家浅谈一下Image-based空间组学中的“摩斯密码”，即如何通过有限的信号标记实现高通量基因的原位解读。

2进制

“2进制”信号编码策略，借鉴了计算机中的方法，在显色过程中进行多轮成像。每个位置在当前成像中根据信号的有无被标记为1（有信号）或0（无信号）。经过多轮成像后，可以根据这些标记确定该位置的基因信息。MERFISH正是采用了这种方法（图1），在排除用于纠错的成像轮次后，理论上通过N轮成像可以探索2^N个基因在空间中的分布情况 (当在N轮杂交中使用C种颜色进行成像可达到2NC个基因)。

图1.MERFISH中的“2”进制编码策略（来自文献）

4进制

与“2进制”不同，“4进制”以基因中的“ATCG”四种碱基为基础，在进行显色时，同样需进行多轮成像，但每一轮的成像有四种能被显微镜区分标记，基于测序的空间组方法在测序时即是以此为原理（图2）。此外，受新一代测序技术启发，原位测序如ISS和FISSEQ技术皆是使用此类编码方法，即在原位将靶基因标记且放大信号后，通过测序的方法解读标记信息，在N轮成像后便可解读4^N个基因在空间中的位置信息。0

图2.基于测序的空间组中“4”进制编码策略（网络转载）

图3. ISS中的“4”进制编码策略

10进制

为了提高每一轮的可检测数量，多组学双端原位测序技术（MiP-seq）在“4进制”的基础上发展出“10进制”的编码方式，即一次成像得到10种标记的空间位置信息，使得显微镜在有限的荧光通道（channel）中获得更高效的输出。“一次成像10种标记”用到的是“组合”方式，将4个标记两两组合（可重复），最终得到10种标记(图4)，再通过N轮次成像，获取10^N个基因在空间中的位置信息。

图4.MiP-seq中的单轮荧光组合策略

F进制

以上方法之外，还有不受显微镜成像限制的编码理念，可以总体归纳为F进制的编码方式，例如序列原位杂交（seq-FISH）所提出的方案，每轮F种标记使用显微镜逐个成像，而非同时成像，最后通过N轮成像、解读后将F^N个基因在空间的位置解读出来。

图5.seq-FISH中单轮20种标记的编码策略（来自文献）

随着研究需求不断扩展，尤其是在检测效率和空间精度方面的要求日益提高，Image-based空间组学凭借其独特的检测灵敏度和空间分辨率特有优势，逐渐成为满足复杂研究需求的重要手段。但Image-based的空间组技术平台都面临着共同问题，即受荧光标记与荧光显微镜通道的限制，每轮实验所能实现的编码数量有限。当靶标通量增加，荧光信号的密集性也显著提高，导致光学信号通道之间的拥挤现象。这种拥挤不仅影响信号的检测效率，还使得解码过程变得愈加复杂和困难，且这一问题是所有基于成像的空间组学技术平台都面临的挑战，目前技术水平尚不易解决。因此在现阶段针对中通量靶标的靶向空间组技术，在深入研究与临床诊断上会更具有开展优势和应用价值。未来，在高通量空间组学技术领域中，如何实现更高通量荧光标记与更高效率的荧光编码，将是推动空间组学技术进一步发展的关键技术瓶颈。

Reference

参考文献：

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