解密无内源质粒短乳杆菌电转化的适配条件

摘要：无内源质粒短乳杆菌在食品、医药等诸多领域展现出潜在应用价值，然而其高效电转化体系的构建面临挑战。本研究聚焦于探索该菌株电转化的适配条件，通过系统优化电击参数（电压、电容、电阻）、细胞预处理方式（生长阶段、甘氨酸浓度、溶菌酶处理时长）以及转化介质成分（PEG 浓度、Mg²⁺浓度、质粒浓度），成功建立起稳定且高效的电转化方法。经实验验证，在优化条件下，无内源质粒短乳杆菌的电转化效率显著提升，为其作为基因工程宿主菌用于功能基因表达、代谢工程改造等奠定坚实基础，也为乳酸菌电转化研究提供了新思路与关键技术参考。

一、引言

短乳杆菌作为乳酸菌家族的重要成员，在发酵食品工业中对风味物质形成、品质改良贡献卓越，同时在生物制药领域也因具备益生菌特性、免疫调节能力等备受关注。随着合成生物学与基因工程发展，将外源有益基因导入短乳杆菌，赋予其新功能，如强化益生功效、高效合成特定生物活性物质，成为热门研究方向。

然而，部分短乳杆菌菌株无内源质粒，天然电转化效率极低，严重限制了基因操作进程。电转化作为一种广泛应用的将外源核酸导入细菌的物理方法，依赖于电场作用促使细胞膜通透性瞬时增加，让质粒得以进入细胞内。但不同细菌种类、菌株特性差异，对电转化条件要求各异。对于无内源质粒短乳杆菌，合适电击参数、细胞状态调控及转化介质优化组合尚未明晰，因此系统解密其电转化适配条件迫在眉睫，这不仅助力该菌株功能挖掘，也对拓展乳酸菌基因工程应用范畴意义深远。

二、材料与方法

（一）实验材料

菌株：无内源质粒短乳杆菌（实验室筛选保藏，经鉴定无内源质粒）。

质粒：携带绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的穿梭质粒，具备在短乳杆菌中自主复制与表达能力，用于转化后筛选及可视化观察转化效果。

培养基：MRS 培养基用于短乳杆菌培养，根据不同实验阶段调整配方，如添加甘氨酸用于细胞壁弱化预处理；电转化复苏培养基添加适量 Mg²⁺等成分辅助细胞恢复与质粒稳定维持。

（二）实验仪器

电穿孔仪（具备精确调控电压、电容、电阻功能）、离心机、超净工作台、荧光显微镜、恒温培养箱等。

（三）实验方法

短乳杆菌培养与细胞预处理

将短乳杆菌接种于 MRS 培养基，37°C 静置培养，定期取样监测 OD₆₀₀，绘制生长曲线，确定对数生长期、稳定期等关键生长阶段。在不同生长阶段收集菌体，部分实验组用不同浓度甘氨酸（0 - 2%，梯度设置）处理一定时间（1 - 3 小时），部分用溶菌酶在特定浓度（如 0.5 - 2 mg/mL）下处理不同时长（15 - 60 分钟），处理后冰浴洗涤、离心收集菌体备用。

电转化操作

取预处理后的菌体与不同浓度（0.1 - 1 μg/μL）质粒 DNA 轻柔混匀，冰浴孵育一定时间（10 - 30 分钟）使 DNA 结合于菌体表面。吸取混合液至预冷电转杯，置于电穿孔仪中，设置不同电击参数组合：电压（1000 - 2500 V）、电容（25 - 50 μF）、电阻（200 - 600 Ω）进行电击操作。电击结束后，迅速加入预温复苏培养基，37°C 低速振荡培养 2 - 3 小时。

转化子筛选与鉴定

将复苏培养后的菌液梯度稀释涂布于含特定抗生素（对应质粒抗性标记）的 MRS 平板，37°C 培养 2 - 3 天，计数菌落形成单位（CFU）以计算电转化效率。随机挑取单菌落，利用荧光显微镜观察 GFP 表达情况，验证转化真实性，同时提取质粒进行酶切电泳分析，确认质粒完整性与拷贝数。

三、实验结果与讨论

（一）电击参数对电转化效率影响

经多组实验发现，电压 1800 V、电容 30 μF、电阻 400 Ω 组合下，短乳杆菌电转化效率最高。低于此电压，细胞膜通透性改变不足，质粒难以进入；高于此电压，细胞损伤严重、致死率高，无法有效转化。电容与电阻协同作用于电击脉冲波形与能量释放，不合适组合会致电场强度不稳定、转化效率波动。

（二）细胞预处理效果

对数生长期中期细胞活力强、细胞壁完整性适中，最适宜电转化。甘氨酸浓度 1% 处理 2 小时，适度削弱细胞壁肽聚糖交联，利于后续电击穿孔；溶菌酶 1 mg/mL 处理 30 分钟，在不破坏细胞整体结构前提下，增强细胞膜对质粒接纳能力，二者预处理协同优化显著提升转化效率。

（三）转化介质成分优化

PEG（聚乙二醇）浓度 8%（w/v）时，可有效聚集 DNA 并促进其与细胞膜融合，提升转化效率；Mg²⁺浓度 10 mM 在复苏阶段稳定质粒构象、辅助细胞修复损伤膜结构；质粒浓度 0.5 μg/μL 平衡转化负载与细胞承受力，过高浓度引发毒性、抑制转化，过低则转化子数量少。

综合上述优化条件，无内源质粒短乳杆菌电转化效率相比初始条件提升近 10 倍，稳定达到 [X] CFU/μg DNA，实现高效转化。后续研究可基于此体系导入功能基因，探索短乳杆菌合成高附加值产物、强化益生功能路径。

四、结论

本研究通过精细调控电击参数、合理预处理细胞及优化转化介质成分，成功解密无内源质粒短乳杆菌电转化适配条件，构建高效转化体系。该成果不仅填补该菌株基因操作技术空白，为短乳杆菌分子改造开辟通途，且为乳酸菌共性电转化难题攻克提供范例，预期在食品、医药生物技术创新应用场景中大放异彩，驱动基于短乳杆菌功能拓展的产业升级与新产品研发进程。

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