适合新手小白看的《农杆菌感受态制备及转化注意事项》

注：OD600=0.5简单判断标准为含有菌液的锥形瓶放在报纸上，能看到但是看不清报纸上的字。通常菌液颜色有点类似我们喝的健力宝饮料的颜色。

当样品多时，涂布可以使用高压过的小玻璃珠进行涂布，省去了烧涂布棒的时间。（本人特别烦烧镊子涂布棒等）涂布时遇到涂不干的板，可以先涂布一次然后开盖在超净工作台吹干一会，再次涂布。

以下是常见的农杆菌感受态制备步骤：

1. 菌株活化：从-70℃或-80℃保存的农杆菌菌株中，用接种环沾取少量菌液，在含相应抗生素的LB或YEB平板上划线，28℃培养1-2天，直至长出单菌落.

2. 预培养：挑取单菌落接种于3-5ml含相应抗生素的LB或YEB液体培养基中，28℃、200-220rpm振荡培养12-16小时。然后取1-2ml菌液转接至50-100ml相同培养基中，继续培养至OD600=0.5左右.

3. 冰浴与离心：将菌液转移至无菌离心管，冰浴30min，使菌液冷却。随后4℃、5000rpm离心5-10min，弃去上清液.

4. 重悬与离心：加入10ml预冷的0.1M的CaCl₂溶液或0.15M NaCl溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min。接着4℃、5000rpm离心5min，去上清.

5. 甘油重悬：加入4ml预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl₂溶液或2ml预冷的含20%甘油的20mM的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞.

6. 分装保存：将农杆菌悬浮液分装于无菌Eppendorf管中，每管100μl，液氮速冻后，存于-70℃或-80℃备用.

转化过程

DNA质量与用量：加入的质粒DNA纯度要高，无杂质和降解，用量一般为10微升左右，过多或过少可能会降低转化效率.

• 冰浴与热激：加入DNA后冰浴时间要足够，通常30min左右，使DNA充分吸附在感受态细胞表面。热激时，温度和时间要严格控制，如37℃水浴5min或42℃水浴1min，热激后需迅速液氮冰浴5min，防止细胞因温度骤变受损.

• 复苏培养：加入培养基后在28℃、150-200rpm的条件下振荡培养2-4h，使细胞恢复活性并表达抗性基因，若使用SOC培养基或者LB复苏，可提高转化效率.

• 涂板操作：涂板时菌液量要根据菌液浓度适当调整，一般取50-200μl菌液涂布于含相应抗生素的平板上，涂布要均匀，避免菌液堆积.