如何利用transwell培养小室法检测细胞的迁移？

transwell培养小室外形为一个可放入孔板内的小杯子，杯子底部为带有微孔的通透性的聚碳酸酯膜，孔径大小为0.1~12μm，可根据不同需要选择合适孔径的transwell。将transwell小室放入24孔板中，transwell培养小室为上室，培养板为下室，上室内加上层培养液，下室内加下层培养液，上下层培养液以膜相隔。当把细胞接种于上室后，由于transwell小室底部的膜具有通透性，下室培养液中成分可影响上室细胞的运动。通过此方法，可比较相同刺激对不同细胞的迁移的影响或不同刺激对相同细胞迁移的影响。除细胞迁移外，transwell也常被用来进行细胞趋化和肿瘤细胞侵袭等多种方面的研究。

方法和步骤

（1）在24孔板中每孔接种8×10^4个细胞，常规条件培养24小时。

（2）弃培养基，用PBS洗涤细胞2次，用消化液消化细胞，继而用无血清培养液重悬细胞，计数，将细胞密度调为30万/ml。

（3）将transwell培养小室放入24孔板中，共分2组，每组3个复孔，一组在小室下层分别加600μl无血清培养基、另一组加600μl含10%胎牛血清的培养液，小室内则加入100μl含3×10^4个细胞的单细胞悬液，常规培养12小时。

（4）取出transwell小室，用甲醇固定15分钟，0.1%结晶紫染色20分钟，用棉签小心擦去微孔膜上层细胞，PBS清洗两次。

（5）细胞计数：在荧光显微镜下给微孔膜下层细胞拍照，每孔拍9个视野，计数。

培养一段时间以后，一部分细胞穿过transwel小室，迁移到孔膜下层，在荧光显微镜下可看到蓝紫色的细胞。孔膜下层细胞数目的多少与细胞运动能力以及下层溶液有关。

注意事项

①将transwell小室小心放入盛有培养液的细胞培养板中，注意孔膜下不要产生气泡。

②染色完毕后，擦净孔膜上层的细胞，且注意保持膜面的平整，以免影响后续拍照。