超详细TUNEL凋亡检测Protocol（珍藏版）

一、实验原理

细胞凋亡时，染色体DNA断裂会产生大量的粘性3'-OH末端，经过固定与破膜后，这些暴露的3'-OH能够在TdT（脱氧核糖核酸末端转移酶）的催化下与带有荧光素标记的dUTP连接，形成衍生物标记到DNA的3'-末端。可以通过荧光显微镜检测荧光强度，来准确地反映出凋亡细胞。

二、自备试剂

细胞样本＞固定液(4%多聚甲醛溶于PBS)。通透液(0.2%的Triton-100溶于PBS)。

石蜡切片＞二甲苯、乙醇。

冰冻切片＞固定液(4%多聚甲醛溶于PBS)。

其他试剂＞PBS、ddH2O、抗荧光淬灭剂的封片液。

三、试剂盒组分与储存

一步法TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒（绿色，SUNNCELL® 488）

-20°C保存。荧光标记液需避光保存。

荧光标记液和TdT酶避免反复冻融，使用前离心涡旋混匀。

四、试剂配制

★1×蛋白酶K工作液：取1μL Proteinase K(100×)加入99μL PBS中，混匀。现配现用。

★1×DNase I Buffer工作液：按照9:1的比例用ddH2O将DNase I Buffer(10×)稀释待用。现配现用。

★ DNase I工作液（200 U/mL）：用1×DNase I Buffer工作液，按照99：1稀释比将DNase I(20 U/μL)稀释待用。现配现用。

注：DNase I会在剧烈混合下变性，建议不要涡旋DNase I溶液。

★DAPI工作液：取4μL DAPI Reagent(25μg/mL)加入96μL PBS中混匀。现配现用。

五、固定与通透

1.细胞样本

1）细胞爬片：将细胞爬片浸入PBS漂洗1次，滤纸吸干周围水分，再浸入固定液（自备），室温固定15~20 min或4°C固定1~2 h。

细胞涂片：收集细胞，加入一定体积的PBS重悬细胞沉淀，然后加入和PBS等体积的固定液（自备），室温固定15~20 min或4°C固定1~2 h。600×g离心5 min，PBS重悬，取25~50μL细胞悬液涂片在载玻片上晾干。

2）固定好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。

3）将样本浸入通透液（自备）中，37°C作用10 min。

4）将通透好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。

2.石蜡切片

1）用常规方法将切片脱蜡水化。将切片浸入二甲苯（自备），脱蜡2次，每次10 min；无水乙醇（自备）浸泡切片2次，每次5 min；90%、80%、70%的乙醇水溶液（自备）各一次，每次3 min。

2）脱蜡好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。

3）滤纸吸干切片组织周围的水分，每个样本上滴加100μL 1×蛋白酶K工作液，37°C反应20 min。

注：不同组织或物种的样本反应时间可能不同。建议进行预实验，确定反应时间。

4）将通透好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。

3.冰冻切片

1）取出冰冻切片，平衡至室温，再浸入固定液（自备），室温（15~25°C）固定30 min。

2）固定好的样本浸入PBS漂洗2次，每次5 min。

3）每个样本上滴加100μL 1×蛋白酶K工作液，37°C反应10~20 min。

注：不同组织或物种的样本反应时间可能不同。建议进行预实验，确定反应时间。

4）将通透好的样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。

六、试剂配制

1.分组设置

★ 阳性对照

1) 滴加100μL 1×DNase I Buffer工作液到已通透的样本上，室温平衡5 min。

2) 用吸水纸去除样本上多余的液体。加入100μL稀释后的DNase I工作液（200 U/mL)，37°C孵育10~30 min。

★阴性对照

1) 滴加100μL 1×DNase I Buffer工作液到已通透的样本上,室温平衡5 min。

2) DNase I Buffer孵育阴性样本，37°C孵育10~30 min。

3) 样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。

★实验组

实验组通透完成后在PBS中静置，等待阳性对照和阴性对照处理后共同进行标记染色。

2.标记工作液的配制

算好样本量集中配制，每个样本用量按照下表配制，充分混匀，现用现配。

注：

a) TdT Equilibration Buffer使用前，室温静置直至完全溶解。冰冻的平衡液融化后可能会出现钴盐结晶，此为正常现象，可在使用前涡旋混匀。

b) Labeling Solution使用前，请置于冰上溶解，待完全溶解后离心，并用枪头吹打混匀。

c) TdT Enzyme对温度较敏感，请严格保存于-20°C，使用前取出，使用后立即放回。

d) 配制标记工作液时，建议不要涡旋。

50μL标记工作液可覆盖的样本面积约为5 cm2，对于表面积更大的样本可以成比例的增加工作液体积。

3.标记步骤

1) 每个样本滴加100μL TdT Equilibration Buffer，37°C湿盒中平衡10~30 min。

2) 吸水纸吸除TdT Equilibration Buffer（注意不要干片)，每个样本滴加50μL标记工作液，放入湿盒中37°C避光反应60 min。

注：如果信号强度较弱，则可延长DNA标记反应的培养时间。某些系统可能需要在37°C下反应4小时。

3) 样本浸入PBS漂洗3次，每次5 min。

4) 吸水纸吸干水分后滴加DAPI工作液，室温避光孵育5 min，对细胞核进行复染。

5) 样本浸入PBS漂洗4次，每次5 min。

6) 用吸水纸吸干多余的液体，用含抗荧光淬灭剂（自备）的封片剂封片。检测

在荧光显微镜下选择合适的滤光片观察结果。

注：荧光易淬灭，请尽快观察拍照。若无法立即观察，请于4°C避光保存。

七、实验结果展示

Positive group：

Hela细胞接种细胞爬片，固定通透，经DNase I 工作液37°孵育10min。

Negative group：

Hela细胞接种细胞爬片，固定通透，经DNase I Buffer 孵育，不加TdT Enzyme

495nm激发光519nm发射波长滤光片或者FITC通道检测，倒置荧光显微镜拍照观察。

八、注意事项

PBS清洗样本后，请尽量除去PBS溶液后再进行下一步操作。实验过程中请保持样本的湿润，防止干片造成的实验失败。

TdT酶工作液现配现用，短暂于冰上保存，长期保存会导致酶失活影响实验结果。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

本说明书中推荐的条件是通用的，用户可根据不同的样本类型和预实验的结果，对样本处理时间、试剂浓度等条件进行优化，选择最合适的实验条件。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

九、FAQs

问：TUNEL检测试剂盒可以同时检测多个不同种属的样本吗？

答：可以检测，从其原理来说，是不分种属的。

问：阳性对照组的荧光强度比较低可能是什么原因？

答：可能的原因有：1) 操作过程中试剂添加有遗漏；2）通透效果不好，3）DNase I工作液的浓度过低。

问：试剂盒中蛋白酶 K和DNase I的作用是什么？

答：蛋白酶 K的作用是来通透细胞膜和核膜，促进反应试剂能充分进入细胞核进行反应。DNase I的作用是阳性对照样本组中用来促使样本发生凋亡的试剂，能检测实验体系及整体实验操作是否准确。

问：怎样避免组织样本总是容易脱落？

答：实验过程操作轻柔，同时可以适当调整蛋白酶K工作液浓度、孵育时间。