细胞复苏失败原因分析——冻存篇

最近经常有同学和小尚反映细胞复苏不起来，复苏是细胞培养的一个常规操作，但其中有诸多细节容易被忽视，复苏成败和冻存、复苏操作都密切相关，稍不注意就可能一失足成千古恨。

本篇主要从冻存角度进行分析，下周将更新复苏操作的原因排查，欢迎同学们收藏追更~

我们先复习一下冻存步骤：

1.提前准备好冻存液备用；

2.离心获得细胞沉淀后，加冻存液轻轻重悬细胞；

3.将细胞悬液转移入冻存管；

4.如果使用程序冻存液，将冻存管放进程序冻存盒，放入-80℃冰箱过夜后液氮保存。如果使用非程序冻存液，则无需冻存盒。

▶冻存常见的错误操作

1.使用常规含血清冻存液（培养基+血清+DMSO）时，没有使用程序降温冻存盒或泡沫盒等保温措施。降温过快形成冰晶将导致细胞破裂死亡，常规含血清冻存液需要搭配冻存盒使用。现在市售的程序冻存盒可以确保温度以1℃/min的速度缓慢下降。没有冻存盒的同学可以将冻存管放在泡沫盒中4℃静置5-10min，再-20℃静置2h后转入-80℃过夜，第二天转入液氮保存。没有冻存盒也没有泡沫盒的同学，建议用无血清非程序冻存液。非程序冻存液含有更多的保护剂，可以直接重悬细胞后置于-80℃冰箱过夜后转入液氮。

2.冻存前细胞状态不好或冻存密度太低。细胞状态良好是复苏成功前提，我们选择对数生长期、汇合度80%以上的细胞进行冻存。如果冻存前细胞培养上清呈橘黄色，建议换液后静置培养4h再冻存。虽然冻存液含有保护剂，但冷冻过程中仍会有少量细胞死亡。因此冻存的密度不能太低，以200-300万/mL/管为宜。如果不方便计数，可以按一个T25瓶冻存1-2管，一个10cm皿冻存2-3管（注意细胞是80%以上汇合度）。

3.直接将DMSO加入细胞悬液而没有提前配制冻存液DMSO被稀释时会放热（好奇的同学下次配冻存液可以摸一下，小编也是偶然摸了才发现的），会对较脆弱的细胞造成损伤。好养的细胞也许没有很大影响，但为了课题顺利，咱还是不能偷懒哈~先配好冻存液，再去处理细胞。

4.冻存液重悬细胞后直接放进液氮，没有经过-80℃冰箱液氮的温度是-196℃，未经梯度降温的细胞直接放进液氮，毫无疑问细胞会死亡。将细胞放液氮罐口降温也不行哈。

5.冻存液配方不合适研究表明5%-10%的DMSO最适合细胞冻存，具体比例要根据细胞种类调整，对DMSO敏感的细胞则需要降低比例。根据小尚的经验，8%DMSO适用于大部分细胞系。同时，还需根据细胞培养难度调整血清比例，越难养的细胞越要多加血清，过于脆弱的细胞可用血清+DMSO冻存，不加培养基。无论用何种冻存液，都建议做冻检再正式冻存：即冻存24h后复苏一支，确认细胞状态没问题，即可进行大批量冻存。冻检成功前要留至少一瓶细胞培养，以免复苏失败导致细胞绝种。

6.冻存条件不当或冻存时间太久通常，液氮储存的时限和稳定性比-80℃冰箱要好很多。-80℃冰箱由于经常会开关门，温度不够稳定，导致细胞活率下降比较快，因此细胞尽量液氮保存。没有液氮罐的同学，把冻存管放在-80℃冰箱靠里面的位置，定期复苏检测活性。