PCR常见问题

问题1：非特异性扩增

原因：①引物特异性差；②模板或引物浓度过高；③酶量过多；④Mg2+浓度偏高。

对策：①重新设计引物或者使用巢式 PCR；②适当降低模板或引物浓度；③适当减少酶量；④降低 Mg2+浓度，或更换 mix；⑤采用TD-PCR

问题2：GC-rich（正常范围为40-60%，>60%为GC-rich）区域难以扩增

原因：GC-rich 区域需要更高的温度才能打开双链，常规的变性温度下可能解链不完全; 同时由于单链的 G+C 丰富区易于自身互补配对形成稳定的发夹二级结构而使 PCR 引物难以结合到模板上，DNA 聚合酶也难以延伸或延伸停止，结果出现严重的非特异性条带，甚至扩增不出靶基因。

对策：①提高预变性温度或变性时间，使双链完全打开；②TD-PCR（梯度 PCR ）；③换用热启动酶或 mix；④增加 DMSO 等共溶剂，协助 DNA 变性，降低引物 Tm 值，提高产物扩增特异性。⑤采用GC buffer等

问题3：拖尾——产物在凝胶上呈模糊不清状态（弥散）

原因：模板不纯；引物浓度不够优化；Buffer不合适；退火温度偏低；.酶量过多；dNTP、Mg2+浓度偏高；循环次数过多。

对策：①纯化模板；对引物进行梯度稀释；②更换Buffer；③适当提高退火温度；适量用酶；④适当降低dNTP和镁离子的浓度；⑤减少循环次数。

问题4：扩增效率低

原因：引物与模板的结合效率不高、DNA聚合酶活性不足、PCR循环数不够等。扩增效率低下会导致特异性产物产量减少，影响实验结果。

对策：①优化引物与模板的结合条件，提高引物与模板的结合效率； ②检查DNA聚合酶的活性，确保其正常工作。可以更换酶或者使用激活剂；③增加PCR循环数，确保特异性产物得到充分扩增；④优化PCR反应体系，确保各成分比例合适，提高反应效率。⑤电泳： PCR电泳无扩增条带

原因：酶失活或在反应体系中未加入酶、模板含有杂质、变性温度太高、反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶、引物变质失效、引物错误

对策：①重新扩增确保酶加入；②重新制备模版；③降低退货温度货采用TD-PCR；④可以尝试在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5-10分钟；⑤重新合成新的引物；⑥重新设计新引物