多肽合成定制：单链多肽合成方法

一、基本介绍

单链多肽在生物医学、药物研发、生物技术等众多领域展现出重要的应用价值。固相合成法因其操作简便、纯度较高且易于自动化等优势，成为合成单链多肽的常用方法。然而，该方法涉及多个复杂步骤，每个环节的精细操作与优化对于获得目标多肽至关重要。本文详细描述了一种单链多肽固相合成的具体实验步骤与方法，以期为相关研究人员提供参考。

二、材料与方法

实验材料

· 试剂：N,N - 二甲基甲酰胺（DMF）、甲醇、G3 孔的分子筛、空白 Wang 树脂、C 端第一个氨基酸、4 - 二甲氨基吡啶（DMAP）、N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）、哌啶、茚三酮、KCN、苯酚、C 端第二个氨基酸、2 - （1H - 苯并三唑 - 1 - 基） - 1,1,3,3 - 四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）、1 - 羟基苯并三氮唑（HOBT）、N,N - 二异丙基乙胺（DIEA）、三氟乙酸（TFA）、三异丙基硅烷（TIS）、1,2 - 乙二硫醇（EDT）、乙醚、纯水

· 仪器：反应管、沙芯抽滤装置、N₂供气装置、加热设备、离心机、高效液相色谱仪（HPLC）、质谱分析仪（MS）

实验方法

1.1 溶剂的处理

DMF、甲醇在使用前用G3孔的分子筛浸泡过夜除杂质和水。

1.2 树脂的充分溶胀

称取2.0 g 空白Wang树脂于洁净干燥的反应管中，加入15 mL DMF，室温活化30 min左右。

1.3 接第一个氨基酸

室温下，通过沙芯抽滤掉上步溶剂，加入1 mmol 5倍摩尔过量的 C端第一个氨基酸，5倍摩尔过量的DMAP，5倍摩尔过量的DIC，DMF做溶剂室温反应3 h。反应完毕用DMF洗4~6次，每次5-6 mL。再加入体积比为1:1的适量吡啶和乙酸酐，反应30 min。反应完毕用DMF洗4~6次，每次5-6 mL。（作用：封闭掉没有反应的空载树脂上的活性微点。）

1.4 Fmoc保护基的离去

抽滤去掉上步溶剂，将10 mL 20%的哌啶DMF溶液加入到树脂中，N2搅拌10 min后滤出溶液，再加入10 mL 20%的哌啶DMF溶液，N2吹动搅拌5 min再滤去溶液，反复重复此操作两次后，用DMF洗4次，甲醇洗2次，每次5-6mL。

1.5茚三酮检测脱除效果

取出少量树脂，用甲醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃–110℃加热5 min，变深蓝色为阳性反应，说明脱除完全，即可进行下步反应；若呈无色，说明保护基没有脱除完全，则需要重复以上脱保护操作。

1.6 接第二个氨基酸及Fmoc保护基脱除

称取3倍摩尔过量的C端第二个氨基酸，3倍摩尔过量的HBTU和3倍摩尔过量的HOBT于反应管中，加入适量DMF溶液使其完全溶解后，再加入10倍摩尔过量的（纯的）DIEA，室温反应40 min，用DMF洗4~6次，每次5-6mL。取少量树脂用茚三酮检测试剂检测，显无色，然后加入10 mL 20%的哌啶DMF溶液脱Fmoc，进行两次，分别为10min、5min，之后用DMF洗4次，甲醇洗2次，每次5-6mL。取出少量树脂用茚三酮检测试剂检测，检测为蓝色，即可进行下一步反应。

1.7以此类推，重复2.6的步骤，直到合成到N端最后一个氨基酸，去掉Fmoc保护基，然后抽干。

1.8树脂的脱落及纯品分离检测

最后用三氟乙酸切割液（95% TFA：2%TIS：2%EDT：1% H2O）切割2 h，抽滤反应液，得多肽的三氟乙酸溶液，将裂解液用氮气尽量吹干，再用乙醚沉淀，离心，然后用乙醚洗3~5次，得白色固体，用纯水溶解后，经HPLC脱盐提纯，冻干后析出晶体，取少量MS分析。

三、结果与讨论

通过上述详细的实验步骤，成功合成了目标单链多肽。在合成过程中，对每个步骤的严格控制和精细操作是确保合成成功的关键。例如，溶剂的处理直接影响反应的进行和产物的纯度；树脂的充分溶胀能够提高氨基酸的连接效率；Fmoc 保护基的有效脱除和氨基酸的准确连接决定了多肽序列的正确性。

茚三酮检测方法为Fmoc 保护基的脱除效果提供了直观、可靠的判断依据，及时发现并纠正了可能出现的保护基脱除不完全问题。在多肽的切割、分离与检测环节，三氟乙酸切割液的选择和 HPLC 脱盐提纯以及 MS 分析等方法的运用，确保了最终得到高纯度、结构正确的目标单链多肽。

然而，在实验过程中也可能遇到一些挑战，如个别氨基酸连接反应的效率较低、副反应的发生等。针对这些问题，未来的研究可以进一步优化反应条件，探索更有效的缩合剂和添加剂，以及改进实验操作技巧，以提高单链多肽合成的效率和质量。

四、结论

本文所描述的单链多肽固相合成方法，经过一系列严谨的实验步骤和优化措施，能够实现单链多肽的高效、准确合成。从溶剂处理到最终的多肽检测，每个环节都紧密相连，相互影响。通过对各步骤的精确控制和不断优化，有望为单链多肽在更多领域的应用提供有力的技术支持，推动相关研究的深入发展。同时，本方法也为从事多肽合成研究的科研人员提供了一种实用的参考方案，有助于他们在实际工作中更好地开展实验研究。