细胞凋亡DNA Ladder抽提试剂盒（离心柱式）实验操作原理

原理

细胞在发生凋亡时，核酸内切酶激活，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200 bp或其整倍数的DNA Ladder。DNA Ladder是细胞凋亡的一个重要指标，通常观察到DNA ladder，就可以判定细胞发生了凋亡。细胞凋亡DNA Ladder抽提试剂盒（离心柱式）通过DNA纯化柱方式抽提DNA Ladder，比用传统的酚氯仿抽提酒精沉淀方法更加便捷，小片段DNA不容易损失，可以非常有效地抽提最小片断为180-200bp的DNA Ladder，同时又可以抽提到50 kb以上的基因组DNA。

自备耗材

·可调节式移液枪及枪头、离心管

·离心机、涡旋振荡器

·水浴锅、凝胶电泳仪

·无水乙醇、PBS

·琼脂糖、TAE、Loading Buffer、DNA Marker、EB

试剂准备

Lysis Buffer A：即用型；室温保存。

Lysis Buffer B：即用型；室温保存。

Wash Buffer A：第一次使用前50 T添加9 mL无水乙醇，100 T添加18 mL无水乙醇，混匀并做好标记；室温保存。

Wash Buffer B：第一次使用前50 T添加32 mL无水乙醇，100 T添加64 mL无水乙醇，混匀并做好标记；室温保存。

Elution Buffer：即用型；室温保存。

RNase A：即用型；-20℃保存。

Proteinase K：即用型；-20℃保存。

实验步骤

注意：需使用56℃或70℃水浴，请提前作好准备。

A. 细胞样本

1. 收集约1×106个细胞，加入200 μL PBS，轻柔混匀，使细胞重悬于PBS中。

注意：如果使用冻存的细胞沉淀，先把细胞沉淀解冻，并轻轻弹散，然后再加入PBS重悬细胞。

2. 加入2 μL RNase A，轻柔涡旋混匀,室温放置3-5 min。

3. 加入10 μL Proteinase K，轻柔涡旋混匀。

4. 加入200 μL Lysis Buffer B，轻柔涡旋混匀，70℃孵育10 min。

注意：加入 Lysis Buffer B后必须立即涡旋混匀。不可把Proteinase K直接和Lysis Buffer B混合。

5. 加入200 μL无水乙醇，轻柔涡旋混匀。

注意：加入乙醇后可能产生白色沉淀，属正常现象。

6. 把步骤5中的混合物（包括可能产生的沉淀）加入到Spin Column。12,000 rpm离心1 min，倒弃Collection Tube内液体。

注意：进行本步骤前需将Spin Column置于Collection Tube上。倒弃废液后回收Collection Tube。必须把沉淀全部转移到Spin Column内，否则会严重影响抽提效果。

7. 加入0.5 mL Wash Buffer A（使用前先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心1 min，倒弃Collection Tube内液体。

8. 加入0.6 mL Wash Buffer B（使用前先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心1 min，倒弃Collection Tube内液体。

9. 12,000 rpm离心2 min，去除残留的乙醇。

10. 将Spin Column置于一新的1.5 mL离心管上，开盖室温干燥3-5 min，加入50-100 μL Elution Buffer。室温放置 1-3 min。12,000 rpm离心1-2 min。所得液体即为纯化得到的总DNA。

注意：为提高DNA提取量，可以将Elution Buffer预热至56℃再洗脱，也可将第一次洗脱所得溶液重新加入Spin Column进行洗脱。

11. 取部分抽提得到的DNA，1%琼脂糖凝胶电泳分析。

注意：如果细胞发生凋亡，即可观察到典型的 DNA Ladder。电泳时一定要注意换用新鲜配制的电泳液，DNA凝胶也要用新鲜配制的电泳液配制并新鲜配制后使用。电泳时为获取最佳的电泳效果使Ladder充分分开，电泳速度宜适当慢一些，凝胶宜适当长一些，而加样孔宜更加扁平一些。选取适当较薄的梳齿，往往会获得更好的Ladder电泳效果。

B. 动物组织样本

注意：与培养细胞相比，动物组织样本凋亡细胞出现的部位不定、规律性差，取样部位及取样量的不同，均会显著影响最终DNA Ladder的提取效果，建议有丰富经验的用户使用本试剂盒提取组织凋亡DNA Ladder。

1. 称取不超过25 mg的组织（脾脏不超过10 mg），剪切成尽可能小的碎片，加入190 μL Lysis Buffer A。

注意：请勿使用过多的样品，过多的样品会导致抽提效果下降。较小的组织碎片会使裂解速度加快，裂解效果提高。新鲜或冻存的组织均可。

2. 加入10 μL Proteinase K，轻柔涡旋混匀，56℃孵育直至完全裂解。

注意：在孵育期间可以偶尔取出样品Vortex以加快裂解速度。裂解的时间因组织不同而有所不同，通常可在1-3 h内完成。为方便起见，可以直接裂解过夜，裂解过夜对抽提效果无任何负面影响。组织完全裂解后可以呈粘稠状，但不应该呈可把Spin Column堵住的凝胶状。如果消化过夜仍呈凝胶状，说明样品用量过多，作为补救措施，可以把整个反应体系放大一倍。也可组织样本经液氮研磨成面粉状，缩短裂解时间。

3. 加入2 μL RNase A，轻柔涡旋混匀,室温放置3-5 min。

4. 涡旋混匀15 s，加入200 μL Lysis Buffer B，涡旋混匀，70℃孵育10 min。

注意：加入Lysis Buffer B后需立即涡旋混匀。加入Lysis Buffer B后可能会产生白色沉淀，但大多数情况在70℃孵育后会溶解。即使70℃孵育后仍有白色沉淀也不会干扰后续实验。有些组织例如肺、脾，在加入样品裂解液B后可能会形成凝胶状物，此时需剧烈晃动或涡旋样品，以尽量破坏凝胶状物。

5. 后续步骤同A.5-A.11细胞样本的步骤。

注意事项

1. 温度较低时Lysis Buffer A和Lysis Buffer B中可能会有沉淀产生，属正常现象。如有沉淀，56℃水浴孵育溶解沉淀，混匀后使用。

2. 本试剂盒所有操作均在室温进行，所有离心也均在室温进行。

3. Collection Tube在一次抽提中需多次使用，切勿中途丢弃。