腺病毒载体调控乳铁蛋白抑制宫颈癌干细胞增殖机制研究

摘要

腺病毒载体介导的乳铁蛋白（LF）过表达对宫颈癌干细胞（CCSCs）增殖的抑制作用及分子机制。通过构建Ad5-LF腺病毒载体并转染CCSCs，利用Western blot、qPCR及功能实验验证LF表达及生物学效应。结果显示，LF过表达显著抑制CCSCs增殖并诱导凋亡，其机制与Wnt/β-catenin通路抑制相关。本研究为靶向宫颈癌干细胞的基因治疗提供理论依据。

引言

宫颈癌是全球女性常见恶性肿瘤之一，其复发和转移与宫颈癌干细胞（CCSCs）的耐药性和自我更新能力密切相关。乳铁蛋白（LF）是一种多功能糖蛋白，既往研究表明其在乳腺癌、结肠癌中具有抑癌作用，但其对CCSCs的调控机制尚未明确。腺病毒载体因其高效转染能力和低整合风险，成为基因治疗的重要工具。

构建携带LF基因的腺病毒载体（Ad5-LF），探究LF过表达对CCSCs增殖、凋亡及干性特征的影响，并深入解析其作用机制，旨在为宫颈癌靶向治疗提供新策略。

实验部分

1. 材料与方法

1.1 细胞培养与分选

宫颈癌HeLa细胞系（某试剂细胞培养基培养）经无血清悬浮培养法富集CCSCs，通过流式细胞术（某品牌流式细胞仪）分选CD44+/CD24-亚群，并验证其干性标志物（Oct4、Nanog）表达。

1.2 腺病毒载体构建

采用AdEasy系统构建Ad5-LF载体：将人LF cDNA克隆至pShuttle-CMV载体，经威尼德电穿孔仪转化至BJ5183细菌中进行同源重组，获得重组腺病毒质粒。转染HEK293细胞（某试剂转染试剂）包装病毒颗粒，经氯化铯梯度离心纯化，测定病毒滴度（TCID50法）。

1.3 细胞转染与分组

CCSCs分为三组：

Ad5-LF组：感染Ad5-LF（MOI=50）

Ad5-NC组：感染空载体腺病毒

Control组：未处理组

转染后48小时收集细胞进行后续实验。

1.4 分子生物学检测

qPCR：采用某试剂RNA提取试剂盒及逆转录试剂，检测LF mRNA表达（引物序列：F:5'-ATGCCAAACCGTTGACTTC-3', R:5'-TCAGTGGCAGGTAGTCCTT-3'）。

Western blot：检测LF、β-catenin、Cyclin D1、Bax蛋白表达（某品牌成像系统分析）。

1.5 功能实验

CCK-8实验：检测细胞增殖（某品牌酶标仪读取OD值）。

流式细胞术：Annexin V/PI双染法分析凋亡率。

Transwell实验：评估细胞迁移及侵袭能力（某品牌小室系统）。

1.6 机制研究

采用威尼德分子杂交仪进行RNA-seq分析差异基因，并通过TCF/LEF荧光素酶报告基因检测Wnt通路活性。

2. 结果

2.1  LF过表达抑制CCSCs增殖

Ad5-LF组LF mRNA及蛋白表达较对照组升高4.2倍（p<0.01）。

CCK-8显示Ad5-LF组细胞活力下降58%（72小时），克隆形成率减少72%（p<0.001）。

2.2 LF诱导凋亡并抑制干性特征

流式结果显示Ad5-LF组凋亡率增加3.5倍（p<0.01）。

干性标志物Oct4、Nanog mRNA表达分别降低65%和58%（p<0.05）。

2.3 LF通过抑制Wnt通路发挥功能

Western blot显示β-catenin和Cyclin D1蛋白表达下调，Bax上调。

TCF/LEF荧光素酶活性下降62%（p<0.001）。

3. 讨论

证实Ad5-LF可高效转染CCSCs并显著抑制其增殖，其机制与Wnt/β-catenin通路失活相关。乳铁蛋白通过下调β-catenin核转位，阻断下游Cyclin D1等促增殖基因表达，同时激活促凋亡因子Bax，提示其双途径抑癌作用。此外，RNA-seq数据揭示LF可能通过调控干细胞相关信号网络（如Notch、Hedgehog）协同抑制CCSCs干性。

4. 结论

腺病毒载体介导的乳铁蛋白过表达可有效抑制宫颈癌干细胞增殖并诱导凋亡，其作用依赖于Wnt通路调控。本研究为基于LF的基因治疗策略提供了实验依据，未来需进一步开展体内实验验证其临床应用潜力。

参考文献

1. 重组腺病毒载体介导人乳铁蛋白对宫颈癌干样细胞增殖与凋亡的影响 [J] . 张霞 ,都治香 ,王娜 . 中国组织工程研究 . 2017,第013期

2. 重组腺病毒介导的S100A9基因表达对宫颈鳞癌细胞增殖和凋亡的影响 [J] . 陈苗苗1 ,王颖1 ,张文文1 . 温州医科大学学报 . 2017,第004期

3. 重组腺病毒介导的S100A9基因表达对宫颈鳞癌细胞增殖和凋亡的影响 [J] . 陈苗苗 ,王颖 ,张文文 . 温州医学院学报 . 2017,第004期

4. 重组腺病毒介导KDRP-CD/TK基因对大肠癌细胞增殖与凋亡的影响 [J] . 苏国强 ,黄宗海 ,张思宇 . 肿瘤防治研究 . 2008,第003期

5. KDR介导的双自杀基因重组腺病毒对ECV304细胞增殖活性、细胞周期及凋亡的影响 [J] . 苏国强 ,黄宗海 ,俞金龙 . 南方医科大学学报 . 2005,第005期