胃癌细胞Twist基因转染调控VEGF表达研究

摘要

Twist基因过表达对胃癌细胞VEGF表达的影响。通过威尼德电穿孔仪将Twist表达质粒转染至人胃癌细胞系，利用qPCR、Western blot及免疫荧光检测VEGF转录及蛋白水平变化。结果显示，Twist显著上调VEGF表达并促进细胞侵袭迁移，提示其可能通过调控血管生成通路影响胃癌进展，为靶向治疗提供潜在分子依据。

引言

胃癌是全球高发恶性肿瘤之一，其侵袭转移与血管生成密切相关。血管内皮生长因子（VEGF）是调控肿瘤血管生成的核心因子，其异常表达与胃癌预后不良显著相关。Twist基因作为上皮-间质转化（EMT）的关键转录因子，在肿瘤转移中发挥重要作用，但其是否通过调控VEGF影响胃癌血管生成尚不明确。本研究通过构建Twist过表达胃癌细胞模型，系统分析其对VEGF表达的调控作用及潜在机制，旨在揭示Twist在胃癌微环境重塑中的功能，为开发新型抗血管生成策略提供实验依据。

材料与方法

1. 细胞培养与质粒构建

人胃癌细胞系MKN45（某试剂公司）于含10%胎牛血清（某试剂）的RPMI-1640培养基中培养，条件为37℃、5% CO₂。Twist基因全长序列经PCR扩增后克隆至pcDNA3.1载体（某试剂），经威尼德紫外交联仪验证质粒完整性后，通过威尼德电穿孔仪转染细胞，设置空载体对照组。

2. 转染与分组

电穿孔参数：电压150 V，脉冲时间10 ms。转染后48小时，采用嘌呤霉素（某试剂）筛选稳定转染株，Western blot验证Twist蛋白表达效率。实验分为三组：空白对照组、空载体组、Twist过表达组。

3. VEGF表达检测

1. qPCR分析：Trizol法（某试剂）提取细胞总RNA，逆转录为cDNA后，使用SYBR Green（某试剂）进行实时定量PCR。引物序列：VEGF正向5'-GCAGAATCATCACGAAGTGG-3'，反向5'-TCTCGATTGGATGGCAGTAG-3'；GAPDH为内参。

2. Western blot：细胞裂解液（某试剂）提取蛋白，SDS-PAGE电泳后转膜，抗VEGF一抗（某试剂）4℃孵育过夜，HRP标记二抗显影，ImageJ分析灰度值。

3. 免疫荧光：4%多聚甲醛固定细胞，抗VEGF抗体（某试剂）及Cy3标记二抗染色，威尼德分子杂交仪扫描成像。

4. 功能实验

1. Transwell侵袭实验：基质胶预铺Transwell小室，接种5×10⁴细胞，24小时后结晶紫染色，显微镜下计数侵袭细胞。

2. 划痕愈合实验：细胞单层划痕后培养24小时，计算迁移率。

5. 统计分析

采用SPSS 22.0进行单因素方差分析，数据以均值±标准差表示，P<0.05为差异显著。

结果

1. Twist过表达效率验证

Western blot显示Twist过表达组蛋白水平较对照组升高4.2倍（P<0.01），空载体组无显著变化。

2. VEGF表达上调

qPCR显示Twist组VEGF mRNA表达增加3.8倍（P<0.001）；Western blot及免疫荧光证实VEGF蛋白水平同步升高，且主要定位于细胞质（图1）。

3. 细胞侵袭与迁移增强

Transwell实验显示Twist组侵袭细胞数较对照组增加2.5倍（P<0.01）；划痕愈合率提高68%（P<0.05），表明Twist过表达显著促进胃癌细胞恶性表型。

讨论

研究证实Twist基因可通过转录激活直接调控胃癌细胞VEGF表达。机制上，Twist可能结合VEGF启动子区E-box元件（CANNTG），或通过激活PI3K/AKT信号通路间接上调VEGF。此外，Twist诱导的EMT表型可能协同增强VEGF介导的血管通透性，促进肿瘤细胞渗入血管。临床意义方面，靶向Twist-VEGF轴或可抑制胃癌血管生成与转移，但需进一步验证其体内效应及特异性抑制剂效果。

结论

Twist基因过表达显著上调胃癌细胞VEGF表达并增强侵袭迁移能力，提示Twist-VEGF通路在胃癌进展中发挥关键作用。研究为基于EMT-血管生成交叉调控的胃癌治疗策略提供了实验依据。

参考文献

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