组织潴留Tmem所启动的早期免疫压力影响NSCLC的肿瘤进化
今天讲解的是2023.5.8发表在cancer cell上的一篇名为“Early immune pressure initiated by tissue-resident memory T cells sculpts tumor evolution in non-small cell lung cancer”的文章。在这边文章中，作者通过动物模型与不同分期肺腺癌数据，发现免疫逃逸与肿瘤发生的环境有关。“免疫压力”出现的时间是除了免疫浸润和TMB水平外另外一个重要的决定肿瘤免疫原性的重要因素。
研究背景
肺腺癌可以发生于吸烟者(ES)或非吸烟者(NS), 其中EGFR、ROS1和ALK的改变在NS肿瘤中更为常见，而KRAS、TP53、KEAP1、BRAF和JAK2/3的改变在ES肿瘤中更为常见。NS患者免疫治疗反应较差，与其较低的TMB和较低的PD-L1表达有关。对于ES患者来说，吸烟诱导的因素也可能影响免疫治疗的反应性。作者推断，肿瘤发生前Trm细胞丰度和激活状态可能会对ES和NS患者的肿瘤演变产生不同的影响，并可能对治疗反应起决定性作用。
研究结果
1. ESs的健康肺组织中Trm样细胞具有更强的活性。
首先作者使用流式和CyTOF检测了肺癌手术标本邻近正常肺组织和器官捐献的正常肺组织中具有Trm样表型(CD3+CD45RO+CD45RA-CCR7-CD69+CD103+/-)的CD4+和CD8+ T细胞的比例，并发现: 1) 这些细胞的比例不受年龄、性别及癌症状态的影响。2) 与NSs相比，ESs肺组织中CD8+ Trm样细胞、B细胞的比例显著增加，其中Trm的增加与吸烟史的程度无关 (Fig 1上)。
文献提示，在T细胞活化的早期阶段，共刺激分子(CD28、CD27、41BB和OX40)占主导地位；在T细胞应答的高峰期，共刺激和共抑制分子均上调；而在应答结束时，共抑制受体(CD57、PD-1、LAG3、TIM3)占优势。因此，作者通过CyTOF技术检测Trm样细胞中相关分子的表达情况来推测Trm细胞的激活状态。数据表明，相较于NS患者，ES肺CD4+ Trm样细胞中，而非Treg或CD8+ trm样细胞中，具有更高的CD27、CTLA-4和ICOS表达水平，促使ES患者肺Trm样细胞具有更高的共刺激和共抑制分子表达水平。此外，ES肺CD8+ Trm样细胞高表达PRF，提示ES肺Trm具有更高的细胞毒性。接着作者从肺组织中提取纯化T细胞，用抗CD3/ CD28刺激48或72h，并发现ES肺CD4与CD8 T细胞具有更强的增殖能力。上述的结果证明ES患者肺Trm样细胞激活增强，处于准备发挥效应功能的状态 (Fig 1 下)。
2. ES肺肿瘤更早的出现Trm样细胞的激活。
NS肺中Trm样细胞呈现较低的激活状态促使作者想要了解在肿瘤进化过程中Trm细胞的表型变化。作者使用原发性早期与晚期肺肿瘤手术切除样本来模拟肺癌随时间的演变，作者使用上皮性肿瘤从早期(I-IIIa期，有限淋巴结转移N0-2, M0)到晚期(IIIb-IV期，广泛淋巴结转移N2-N3, M0-1)癌症的多阶段进展来代替肿瘤进展过程。与正常肺组织相比，作者发现: 1)ES和NS早期肿瘤均富含组织潴留Tregs; 2) NS早期肿瘤富集CD8+ Trm样细胞，而在晚期肿瘤并不继续增加。ES患者的CD4+和CD8+ Trm样细胞的激活状态随着分期(正常-早期-晚期)呈现逐渐上调的趋势，而在NS患者的Trm样细胞的活化仅出现在在疾病晚期。对比NS，ES的早期肿瘤中的Trm样细胞具有更高的T细胞辅助分子表达水平，其中也包括了抑制分子，提示仅有ES肿瘤Trm样细T胞中具有耗尽表型。然而这种在NS与ES之间的差异并不存在于晚期肿瘤 (Fig 2)。
ESs具有更高的Trm活性可能与其较高的呼吸道感染率有关，因此作者通过检测CD39(一种区分肿瘤反应性和旁观者T细胞的marker)的表达来了解ESs的Trm样细胞是否是肿瘤特异的。虽然肿瘤富含CD39+ Trm样细胞，但在早期肿瘤中，其比例并不受吸烟状况的影响，提示ES和NS肿瘤具有多克隆Trm样细胞反应。为进一步验证上述的结论，作者从已发表的NSCLC RNA-seq数据中开发了一个CD8 Trm基因集，对来自TCGA队列和TRACERx队列的更大样本量的LUAD RNA测序数据进行打分。与前述结果一致，NS早期肿瘤的CD8+ Trm样细胞评分低于ES。在ESs中，CD8+ Trm样细胞评分和TMB均与吸烟暴露水平T均无关。线性回归模型显示，在评估患者年龄、性别、疾病分期、吸烟状况、基因组吸烟标志物的存在、突变驱动因素和TMB时，只有TMB与CD8+ Trm样细胞打分显著相关(Fig 3 上)。由于NS肿瘤中TMB较低，因此作者分析了与NS具有相似TMB水平的ES样本再次进行Trm打分(依据FDA批准的以10个突变/兆基作为TMBhi实体肿瘤使用ICB的标准，即<3)，结果再次表明NS的CD8+ Trm样细胞打分显著低于ES。在TRACERx肿瘤中，不同区域的TMB存在差异，但作者发现所有的ES患者都具有较高的Trm样细胞打分，而并不受TMB的影响。这些数据表明，Trm评分可能不完全由TMB驱动。且与NS相比，Trm样细胞招募和激活在ES肺肿瘤中可能发生得更早(Fig 3 下)。
3. 肺肿瘤发生前的预先存在的Trm样细胞诱导增强了宿主免疫细胞的募集和激活。
为了解先前存在的肿瘤反应性或旁观者肺Trm细胞如何影响肿瘤免疫进化的，作者构建了下属模型：将D45.1供体特异性OVA T细胞(OT-I)或gBT细胞(gBT-I)移入CD45.2宿主体内，同时或不同时经鼻给药polyI:C和OVA或gB多肽，与无TRM对照相比，产生高水平或低水平OVA (CD45.1肿瘤特异性OT-I TRM样细胞:T- TRM细胞)或gB (CD45.1旁观者gBT-I TRM样细胞:by-TRM)CD8 Trm。两周后，静脉注射表达OVA肽的肺肿瘤细胞构建原位肿瘤模型，并在肿瘤细胞注射前(Day14)或肿瘤细胞注射后8周(Day70,研究终点)采集样本进行分析（Fig 4A-B)。作者发现，预先存在的Trm样细胞并不影响肿瘤负荷，尽管无或低Trm组的一些小鼠没有存活到研究终点(Fig 4C-D)。与旁观者Trm样细胞组相比，肿瘤特异性trm样细胞组在Day70具有更多表达PD1的CD8+ Trm样细胞，提示OVA+肿瘤细胞支持同源供体Trm样细胞的增强扩增或保留(Fig 4E-F)。进一步分析提示，与低或无Trm组相比，高Trm样细胞组富含CD8+和CD4+ Trm样细胞，且这些细胞高表达PD1 (Fig 4 row 3)。同样的，增殖的CD8+ T细胞在高Trm样细胞组中高表达。线性回归分析也证实，在研究终点，供体Trm样细胞的数量与总体肺T细胞数量之间强相关，与Trm的特异与否无关。此外，高trm样细胞组高表达PD-1+ Treg，尽管各组间总Treg并无差异 (Fig 4 row 4)。上述的结果表明，肺组织中预先存在的Trm样细胞，无论TCR特异性如何，都会增强T细胞在肿瘤微环境中的募集和激活。
4. 预先存在的Trm样细胞导致肺肿瘤细胞发生免疫逃避，最终导致免疫治疗耐受。
在富含Trm的环境中生长的肿瘤具有更高T细胞活性，那么这种增强的“免疫压力”是否可以驱动肿瘤细胞发生免疫逃避呢？在高Trm样细胞组中，肿瘤负荷并未降低，但肿瘤细胞上OVA新抗原及MHC I类蛋白H-2Kb表达显著减少，均是免疫逃逸的表现。但这种抗原呈递能力的丧失并不损害IFNγ信号传导(体现在：高Trm组CD4+和CD8+ Teff/em中IFNγ表达增加，肿瘤细胞中的pSTAT1水平无显著变化) (Fig 5 上)。这些结果表明，在肿瘤形成之前，任何肺Trm样细胞的存在都会增强肿瘤细胞的免疫逃逸机制，即使在富含IFNγ的环境中也是如此。既往研究发现抗pd1联合抗ctla4治疗可提高PDL1表达>1%的NSCLC患者的生存。当联合治疗用于对照组或低Trm样细胞组时，部分肿瘤对治疗有响应；而在高Trm样细胞组，肿瘤对治疗完全耐受 (Fig 5 下)。上述结果证实：预先存在的Trm样细胞会加速肿瘤细胞免疫逃逸机制的启动，从而降低对ICB治疗的反应性。
5. 早期的免疫逃避仅存在于ES患者中。
肿瘤进化被认为是一种由输入(如TMB、免疫选择压力）导致免疫逃避(如HLA等位基因杂合性丢失(HLA LOH)和编码抗原呈递机械元件基因的非同义突变(APMmut))发生的系统。由于吸烟状况的确会影响肿瘤微环境Trm样细胞活性，并导致不同的TMB与免疫选择压力，作者最后想要了解ES与NS患者在肿瘤免疫进化是否存在差异。为了推断免疫逃逸事件发生的时间，作者使用多位点测序数据来区分在克隆事件(在所有位点均可检测到的早期逃逸事件)和亚克隆事件(仅在一个或一些位点检测到的晚期事件。分析来自四个队列的侵袭前、早期和晚期肺癌数据中的HLA LOH和APMmut。作者首先使用注释良好的TRACERx队列来探索决定HLA LOH的细胞内在和外在因素，并发现尽管免疫逃避事件的发生与较高的TMB有关，但在一些低TMB的肿瘤中也可发生免疫逃逸事件 （Fig 6 上)。此外，免疫逃避事件的发生与免疫浸润、基因组吸烟特征、及克隆驱动突变状态无关。更为重要的是，NS几乎不发生克隆事件，也较少发生亚克隆事件，表明ES肿瘤总体上有更高的免疫逃避事件发生率。尽管基因组吸烟特征与免疫逃逸事件无关，但吸烟史与免疫逃逸事件相关，这一观察结果进一步表明，肿瘤免疫源性的驱动不仅与烟草诱导的突变有关，同时也收到吸烟诱导的炎症免疫微环境的影响 （Fig 6 下)。综上所述，免疫逃避在NS肿瘤中是罕见的事件，主要发生在ES肿瘤中，提示免疫逃逸在ES肿瘤中是一个连续的事件，可能在其进化的早期就开始了。
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