科普讲堂 | 一起聊聊核酸纯化的方法~

核酸纯化是分子生物学的基础，是将DNA和/或RNA从所有其他细胞和细胞外成分中分离出来,并且去除细胞外所有成分和其他干扰物质。现在常规分子诊断中使用的大多数程序都是基于核酸和硅酸盐的亲和力结合，同时洗掉所有其他成分。通过这种方式，可以得到几乎只含有核酸的纯化洗脱液。以前，核酸研究的金标准是苯酚-氯仿-异戊醇萃取。但现在通过Boom法，花费的时间更少且足够有效。

一、苯酚氯仿抽提法

苯酚氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，变性降解核蛋白，使DNA从核蛋白中游离出来。而DNA易溶于水，却不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。利用萃取原理，根据蛋白核酸溶于不同的试剂层，将枪头伸入不同液层内抽取所需的成分，经多次洗涤后获得纯化核酸。

缺点是：由于使用了苯酚、氯仿等试剂，毒性较大，长时间操作对人员健康有较大影响，而且核酸的回收率较低，损失量较大，由于操作体系大，不同实验人员操作重复性差，不利于保护RNA，很难进行微量化的操作。

优点是：成本比较低廉且抑制了DNase的降解作用。

二、Boom法

Boom在1990年开发了一种方法，利用二氧化硅颗粒与核酸的磷酸基团形成可逆的盐桥。通过这种方式，可以从基质中捕获核酸（见图1）。

这些二氧化硅颗粒可以被离心分离，并与分离物中的其他成分分开。丢弃上清液后，可以加入洗涤缓冲液来重新悬浮颗粒，然后再次离心。通过一些清洗和离心步骤，硅酸盐/DNA复合物与污染物如蛋白质、脂质和其他（大）分子分离，而不像苯酚-氯仿提取那样使用有毒物质。通过将二氧化硅颗粒与各种载体（例如顺磁珠）耦合，有可能简化和自动完成洗涤步骤，并相对容易地从复杂的溶液中分离出DNA。

在洗涤步骤之后，核酸在小体积的低摩尔的缓冲液（含10mM TrisHCl/0.1mM EDTA pH 8.2）中从二氧化硅颗粒中被洗脱出来。纯化的核酸可以被定性并立即用于进一步的步骤。

如今，Boom方法被纳入了自动化系统。通过这种方式，许多样品可以以标准化和无污染的方式被分离出来，这对诊断实验室来说是至关重要的。

为了保存核酸分离物，可以将洗脱缓冲液蒸发掉，得到易于在室温下保存的固体亲水粉末。在使用前，通常将该粉末溶解在相同体积的无核酸酶的水中。另一种方法是将洗脱液冷冻，储存在-20℃或-80℃。