项目文章 | 非因生物助力全面多维表征SCLC微环境和定义新的免疫亚型分型

研究背景

小细胞肺癌（small-cell lung cancer,SCLC）通常被认为是一种“同质性”疾病，患者的治疗方法类似。由于SCLC治疗获益的潜在机制仍知之甚少导致SCLC临床研究和分层治疗策略开发中缺乏指导建议。肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）中免疫景观已被广泛认为是预后和抗肿瘤免疫应答的关键决定因素。然而，由于技术限制，过往SCLC免疫微环境的研究视角有限，只集中于少数特性细胞类型。因此，全面描绘SCLLC的免疫景观对推进治疗策略和改善患者结局至关重要。

研究目的

为了全面、多维的阐明SCLC的免疫学特征，并了解其对预后和治疗临床获益的影响。中国医学科学院肿瘤医院杨琳团队在《Pharmacological Research 》（IF：9.3）杂质发表题为“Multi-dimensional characterization of immunological profiles in small cell lung cancer uncovers clinically relevant immune subtypes with distinct prognoses and therapeutic vulnerabilities”的文章。文章中利用的所有实验技术nCounter靶向转录组分析技术、数字空间全转录谱技术（DSP-WTA）和数字空间蛋白质组学技术（DSP-Protein)均由非因生物提供。

实验设计

研究结果及结论

1. 通过整合靶向基因表达（TGE）和全转录谱（WTA）数据定义SCLC免疫亚型

靶向基因表达谱基因之间Pearson 相关性矩阵的无监督分层聚类确定了3个共表达功能模块，分别为免疫相关通路、EMT和代谢过程、促肿瘤通路，且三个模块彼此间无显著相关性（图1A）。已知29个TME特征基因集合（functional gene expression signatures，Fges）的无监督层次聚类分析将29例SCLC样本分为免疫区室显著不同的两个簇：免疫富集亚型（IE亚型）和免疫耗竭亚型（ID亚型）（图1B）；经IHC验证，IE亚型肿瘤浸润免疫细胞（TIL）高于ID亚型（图1C和图1D）。DE分析结果显示，淋巴细胞介导的免疫和适应性免疫反应等免疫相关过程在 IE亚型中富集，而ID亚型的细胞代谢过程、器官发育和细胞过程的调控则较为丰富（图1E）；通路水平的ssGSEA比较分析显示，IE亚型肿瘤中IFN-α应答、IFN-γ应答、炎症反应通路显著富集。而E2F和 MYC 靶标基因集在 ID 亚型肿瘤中显著富集（图1F）。

图1  免疫基因谱定义的SCLC亚群的特征

2. DSP数字空间组学技术揭示SCLCs 中免疫亚型之间不同的T细胞浸润和功能

通过DSP空间蛋白技术定量29例SCLC FFPE样本中39种免疫肿瘤蛋白（IO）的表达；对组织切片进行CD45（免疫细胞）、PanCK（肿瘤细胞）免疫荧光染色，并圈选83个ROIs（图2A）。CD45 +和CD3+（T细胞标记物）蛋白状态的T细胞评分、细胞毒性评分、ICI评分和TEX评分（详见方法）高于CD45-和CD3组（图2B和图2C）；为了探究CD3+和CD3- SCLC 样本间39种IO蛋白的共定位模式的差异，对这39种IO蛋白进行无监督层析聚类，结果显示，CD3+T细胞与β2微球蛋白、B7-H3、Tim3共定位；而CD3-T细胞与CD11c、CD44共定位（图2D）；将ROI按照CD45表达高低排序，选择CD45++组（immune-rich，top25%)和CD45-/+组（immune-poor，bottom 25%）两组（图2E）进行蛋白表达的比较；箱线图结果显示，CD45++组中CD3、CD8、免疫检查点靶点、免疫激活靶点蛋白表达显著增加（图2F）。总的来说，DSP空间蛋白分析强调了TILs丰富和TILs贫乏亚型的关键差异蛋白，并描绘了ID亚型中肿瘤相关蛋白特征。

图2  DSP蛋白质谱分析验证了CSLC中免疫亚型间不同的T细胞浸润和功能

3. 免疫亚型与接受辅助治疗的SCLC患者的临床获益相关

为了探究免疫亚型与化疗/放疗临床疗效之间的潜在相关性，研究者检测IE亚型和ID亚型相关的DFS和疾病复发率。生存分析结果显示，IE亚型患者表现出更有利的临床结局，而ID亚型患者预后较差且表现出更高的疾病复发率（图3A和图3B）。为了进一步检测免疫亚型在SCLC免疫治疗中的临床相关性，研究者对Roper队列中17例接受anti-PD-1/PD-L1治疗的患者进行了免疫亚型分析。促肿瘤免疫和抗肿瘤免疫的分级活性评分热图结果显示，IE亚型免疫相关通路的富集显著增加且临床受益率（clinical benifit，CB）为50%，而ID亚型未临床受益率（no clinical benifit，NCB） 高达81.8%（图3C）。K-M分析显示，IE亚型患者的OS显著延长（图3D）。

图3 SCLC患者免疫分型的临床相关性

4. CCL5/CXCL9 趋化因子指数作为临床转化免疫表型分型的个体化预测因子

鉴于IFN-γ通路激活对免疫亚型的不同功能状态的关键贡献（图1F）。200个IFN-γ通路相关基因的多平台谱分析和过滤结果显示，两种特异性趋化因子（CCL5和CXCL9）的表达与免疫亚型显著相关，且均在ID亚型中显著上调（图4A和图4B）。这些结果表明CCL5和CXCL9的表达水平是这两种免疫亚型的主要差异。进一步定义CCL5/CXCL9趋化因子指数（CCI）并设置阈值0.4，将SCLC IE亚型和ID亚型患者分为高CCI组（CCIʰⁱ）和低CCI组（CCIˡᵒ)。并通过多中心bulk RNA队列测试CCI的预后价值。K-M分析显示，在不同队列中，与CCIˡᵒ相比，CCIʰⁱ病例的预后更佳，患者生存时间延长（图4C）。另外，CCI在 SCLC 免疫治疗患者中也显示出稳健和极佳的预后价值。Roper队列中的 CCIˡᵒ病例也与预后较差和患者生存期缩短相关（图4D）。

为了将CCI作为预后工具应用于临床，研究者利用另外的30例SCLC患者（12例CCIʰⁱ和18例CCIˡᵒ）的FFPE样本和临床信息进行IHC实验。与预期结果一致，CCIʰⁱ组肿瘤的CCL5和CXCL9蛋白表达显著高于CCIˡᵒ组（图4F和图4G），IHC分析结果也证实了这一点（图4H）。K-M分析显示，CCIʰⁱ组肿瘤的OS和DFS与良好预后和生存延长显著相关（图4I）。综上实验证实了CCI的稳定性和可靠性，并验证了CCI作为一种有前景预测工具的可行性。

图4 双趋化因子(CCL5/CXCL9)指数(CCI)是SCLC的可靠和个性化预后指标

5. 免疫亚型对SCLC 患者进行分层，不同 NE 亚型和 TF 亚型之间存在差异

为了研究免疫分型与前文报道的SCLC肿瘤中TF分型和NE分型之间的关系。研究者对145个SCLC 混合队列样本（CHCAMS队列、GSE60052队列、George队列和Roper队列）进性传统亚型分组（6种，SCLC-A、SCLC-N、SCLC-P、SCLC-Y、NE-高和 NE-低）。桑基图结果显示IE亚型和ID亚型的患者分布在不同的TF亚型和NE亚型中，ID亚型主要存在SCLC-A（78.05%）、SCLC-N（15.85%）和NE-高（92.68%）亚型；IE亚型不仅在SCLC-A（66.67%）、SCLC-N（14.29%）和NE高（60.32%）亚型中富集，而且在SCLC-P（14.29%）和NE低（39.68%）亚型数量增加（图5A）。生存分析结果显示，6种传统亚型中CCIʰⁱ组患者均比CCIˡᵒ组表现出更长的总生存期，尽管有两个亚型无统计学意义，可能是由于样本量有限导致（图5B-G）。以上进一步说明了CCI在SCLC TF 亚型和 NE 亚型中的强大预后价值。

图5免疫亚型对SCLC患者进行分层，并在TF亚型和NE亚型之间存在差异

文章总结

本研究利用高分辨率的DSP空间多组学技术剖析了SCLC免疫结构的异质性，并提出了一个新的免疫分型概念框架，以评估患者的生存结果和治疗反应，从而实现风险分层和适当选择个体化治疗。目前，这是首次使用临床FFPE样本对SCLC免疫微环境进行全面的多维研究，具有重要的临床应用潜力。