CREB共激活剂CRTC2通过调节SREBP1来控制肝脂代谢

基本知识：

1.SREBP与SCAP

SREBP属于转录因子的基本螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链（bHLH-Zip）家族，但它们与其他bHLH-Zip蛋白的不同之处在于，它们是与内质网（ER）结合的非活性前体。入核之前，要经过三个分子进行加工：一种是伴生蛋白，称为SREBP切割活化蛋白（SCAP）；另外两种是蛋白酶，称为位点-1蛋白酶（S1P）和位点-2蛋白酶（S2P）。当细胞的胆固醇耗尽时，SCAP护送SREBP从ER到高尔基体，两种蛋白酶驻留在那里。在高尔基体中，S1P切割SREBP，将SREBP分子分成两半（图1）。bHLH-Zip结构域然后通过S2P介导的第二次切割从膜中释放。NH2-bHLH-Zip结构域，指定为核SREBP（nSREBP），易位到细胞核，通过与多个靶基因的启动子/增强子区域中的非回文甾醇反应元件（SRE）结合来激活转录。SCAP也是SREBP的传感器，当甾醇升高，甾醇抑制SCAP而阻滞SREBP作用。

分类：SREBP-1a是所有SREBP响应基因的有效激活剂，包括介导胆固醇，脂肪酸和甘油三酯合成的基因。SREBP-1c优先增强脂肪酸合成所需基因的转录。SREBP-2优先增强胆固醇合成所需基因的转录。人的SREBP-1a在脾脏和肠道中占主导地位，而在肝脏、脂肪组织和骨骼肌中以SREBP-1c为主。

2.胰岛素信号PI3K-AKT-mTOR经典通路

主mtorc1调节脂质代谢

IRS1/2细胞表面受体连接的蛋白

另外，氨基酸代谢激活脂质通路不激活AKT，直接激活rag小g蛋白激活moorc1。

mTORC1还可以通过lipin1的负调节来调节SREBP转录网络，mTORC1对lipin1的磷酸化调节其亚细胞定位，磷酸化的lipin1存在于细胞质中，去磷酸化的lipin1在细胞核中积累。核脂蛋白1通过降低核SREBP蛋白水平来抑制SREBP依赖性基因转录。

3.CREB,CRTC

CREB:环AMP响应性元件结合蛋白。激活糖异生相关酶

配体与与刺激性G蛋白相连的G蛋白偶联受体（GPCR）的结合，刺激性G蛋白由α亚基，β亚基和γ亚基组成，导致腺苷酸环化酶（AC）的激活，其催化环AMP的合成。 细胞cAMP的增加刺激蛋白激酶A（PKA）信号传导。cAMP与PKA的调节（R）亚基结合，从而促进它们与催化亚基的解离。释放的催化亚基通过被动扩散进入细胞核，并在Ser133处磷酸化cAMP响应元件（CRE）结合蛋白（CREB）。磷酸化的CREB促进含有CRE的启动子的靶基因表达。（CRE:cAMP反应元件是一段由30bp 左右的DNA 片段构成的cAM P 应答序列，这段序列含有高度保守的5′2 TGACGTCA 23′的8碱基回文结构，其主要存在于基因的启动子与增强子上。

CRTC:cAMP调控的转录共激活因子。CRTC2是该家族在肝脏中表达最高的成员，通过与14-3-3蛋白的磷酸化依赖性相互作用被隔离在细胞质中。

去磷酸化进入核内，核内与相关蛋白结合并乙酰化，再喂食还通过诱导 SIK2 介导的 CBP/p2 在 Ser300磷酸化来促进 CRTC300 脱乙酰化，从而破坏 CRTC2-CBP/p300 相互作用。脱乙酰化的CRTC2随后在Lys628上泛素化并靶向蛋白酶体降解。

环AMP和钙信号通过刺激cAMP调节的转录共激活因子（CRTC）的核易位来调节cAMP响应元件（CRE）结合蛋白（CREB）靶基因。在基础条件下，CRTCs通过与14-3-3蛋白的相互作用被磷酸化并螯合在细胞质中。cAMP和钙信号分别通过抑制盐诱导激酶（SIKs，磷酸化CRTC）和诱导CRTC磷酸酶钙调磷酸酶（CN）来促进CRTC去磷酸化。去磷酸化的CRTC易位到细胞核，在那里它与CREB结合并刺激其活性。

protein degradation：蛋白降解

4.COPII 衣被小泡的组分及其形成

负责从内质网到高尔基体的物质运输。COPII 包被由下列蛋白组分形成：小分子GTP结合蛋白Sar1、Sec23/Sec24复合物、Sec13/Sec31复合物以及大的纤维蛋白Sec16。Sar1与 Sec23/Sec24复合体结合在一起，形成紧紧包围着膜的一层衣被，Sec13/Sec31 复合体形成覆盖在外围的一层衣被，Sec16 推测可能是一种骨架蛋白，Sec12 是 Sar1 的鸟苷酸交换因子。

研究背景

胰岛素抵抗与高血糖和高甘油三酯血症有关，是2型糖尿病的核心问题，其主要的代谢调节中心在肝脏。肝脂肪生成由转录因子以组合方式调节，包括过氧化物酶体增殖激活受体γ（PPARc），肝脏X受体（LXR），碳水化合物反应元件结合蛋白（ChREBP）和甾醇调节元件结合蛋白-1c（SREBP-1c），而糖异生由叉头盒蛋白O1（FOXO1），PPARc共激活因子-1a（PGC-1a），cAMP反应元件结合蛋白（CREB）和CREB调节转录共激活因子（CRTC）调节。

CRTC作为CREB共激活剂激活糖异生相关酶，肝脏中以CRTC2为主，作者也曾研究过：CRTC2敲除后糖异生减弱降低血糖增加胰岛素敏感性。有报道称在脂质调节中可能发挥作用。

甾醇调节元件结合蛋白1（SREBP1）是脂肪生成的重要转录调节因子，转录后与内质网结合形成无活性前体形式flSREBP1。为了响应胰岛素信号，SREBP1通过COPII方式转移至高尔基体，剪切为nSREBP1入核表达脂质基因。然而，其在胰岛素抵抗性肥胖和2型糖尿病中活性增强尚不清楚。

在Selective versus Total Insulin Resistance: A Pathogenic Paradox中，分了三组：（A）肝脏对葡萄糖负荷的正常反应。胰岛素导致糖异生减少，脂肪酸和甘油三酯（Tg）的合成增加。     （B）2型糖尿病小鼠（选择胰岛素抵抗）肝脏中的选择性胰岛素抵抗。胰岛素不能减少糖异生，但继续刺激脂肪酸和Tg的合成。产生高血糖症和高甘油三酯血症的致命组合。在糖异生中丧失敏感性，在但在SREBP-1c途径中仍保持胰岛素敏感性。      （C）LIRKO（肝胰岛素受体基因缺失，肝完全性胰岛素抵抗）小鼠肝脏中的总胰岛素抵抗。胰岛素不能减少糖异生，也不能刺激脂肪酸和Tg的合成。导致高血糖而不伴有高甘油三酯血症。

因此，想要知道为什么B脂代谢仍敏感。

结果

1.CRTC2通过调节SREBP1成熟来调节甘油三酯的合成。（主因素CRTC2，表型SREBP1，表达差异）

figure1

exfigure1

exfigure2

组织学1ab：crtc2的有无对甘油三酯的影响，高脂喂养增强对比性。e1a，c：crtc2的有无对胰岛素（不要）和胆固醇（不明显）的影响。

RNAe1b：qPCR发现甘油三酯合成基因表达增加，为SREBP1靶基因

蛋白1c：发现nSREBP1显著升高,flSREBP1降低，且SREBP1mRNA无明显差异，说明CRTC2为转录后介导。

回复实验1d，e2：CRTC2(-/-)过表达CRTC2或敲除SREBP1可使组织表型，转录成脂RNA和蛋白回复至CRTC2+小鼠的量。（不要e2b）

2.SREBP1加工依赖于胞质。

exfigure3

DATD丧失转录共激活区域，DATD/AA只能在胞核。DATD/AA组从e3c和1d可见，定位应在胞质。而DATD胰岛素不增加。

3.CRTC2与ER相关，假设CRTC2可能与参与调节SREBP1转运的蛋白质结合（CRTC2通过与Sec23A竞争与Sec31A的结合来负调节SREBP1加工）（直接）

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已知ER与crtc2有关联，因此猜测CRTC2可能结合SREBP1的转运蛋白。e4b显示了筛选过程，细胞分离出内质网，用CRTC2抗体进行IP试验，收集蛋白进行质谱分析，发现e4c中匹配Sec31A和Sec13的肽段。进行IP试验e4d发现CRTC2与Sec31A直接结合。

figure2

exfigure5

位点预测：e4e得到结合的位点在101-200之间，2b通过保守序列得到第143AA为结合位点？敲除后不影响其转录活性和亚细胞定位e4fg。

2e转运过程受到阻碍。

e5bc和2f动物实验从蛋白和成脂RNA再次证明

已知Sec23A和Sec31A的羧基末端相互作用，因此2c发现CRTC2与Sec31A的相互作用也在羧基末端，猜测CRTC2会影响Sec23A和Sec31A的相互作用。e4h：答案是会，且Sec23A和Sec31A具有更高亲和力。

pull down实验2d，证明其直接与Sec31A结合，且结合不如Sec23A但会减弱两个的结合，W143A则无此功能。

4.mTOR通过CRTC2的Ser136磷酸化调节COPII依赖性SREBP1加工（上游）

已知：SREBP1的加工和核活性是在响应胰岛素信号传导和营养信号传导时诱导的，共同分子是mtorc1。而CRTC2也可受胰岛素的AKT通路调控至磷酸化。推测mtorc1可能调节CRTC2磷酸化从而影响与COPII的结合。

figure3

exfigure6

e6ab用雷帕霉素，胰岛素，氨基酸说明mtorc1可磷酸化CRTC2，CRTC2竞争结合Sec31A而磷酸化不能。

确定mtor是否直接磷酸化CRTC2或Sec31A,23A：e6d做CO-IP证明相互作用; 3a，e6c雷帕霉素处理细胞及对照组用MS测定磷酸化位点，确定CRTC2的Ser136为雷帕霉素直接作用的磷酸化位点。3b更是证明两个分子直接结合。3c回复验证Ser136缺失影响mtor和CRTC2结合，但不影响其转录活性和亚细胞定位e6gf。

6e：CRTC2磷酸化对torin1更敏感相对于Rap。

exfigure7

动物：3d禁食再喂养，再喂养小鼠和胰岛素小鼠CRTC2磷酸化且不与Sec31A结合，胰岛素1比再喂养弱。3eWT作为回复验证nSREBP1和（+/+）水平一样，3e和e7ab从蛋白和RNA说明S136突变体具有更强的抑制性。e7ce表明CRTC2不影响lipin1表达和定位，分别不干扰地影响nSREBP1；e7cdS136A突变不影响torin1的效果。

5.（CRTC2（DTAD/S136A））突变体改善肝脂肪变性和胰岛素抵抗

exfigure8

exfigure9

figure4

CRTC2（S136A）突变体阻断SREBP1加工，想测试这种mTOR缺陷突变体是否能够通过抑制肥胖症中的SREBP1活化来降低肝脏高甘油三酯水平，同时排除糖异生的干扰选择DTAD。

4a，ef8表达验证：高甘油三酯，T2DM，肥胖小鼠的nSREBP1，pmTOR，TG及支链氨基酸均增加；而CRTC2磷酸化增强说明不与Sec31结合，先前的实验和现在的实验得到验证。

4b-e，ef9a-f突变小鼠不影响ALT和AST，体重、脂肪量、食物摄入、能量消耗，但降低了SREBP1加工、脂肪生成速率和糖异生能力，并改善了肝脂肪变性和胰岛素敏感性。钳夹试验4fgh，ef9jk显示敏感性上升。

pAKT在三个模型下降的可能原因：胰岛素抵抗不敏感，AKT不激活，同时foxo1等依赖pAKT的通路不激活，造成糖异生不受抑制而增加。但pmtor及下游增加说明可能模型中氨基酸或其他因子直接激活TSK或mtor导致脂肪生成。因此导致高血糖高血脂。而胰岛素受体敲除小鼠的脂代谢不高可能因为非上述模型体质，无法激活mtor。

小知识：IP实验中，有标签的抗体不用igg阴性对照，无标签的需要。GFP一般是转染质粒的阴性对照组。

考染和银染及wb都需电泳至胶上，但考染和银染直接染色，显示所有蛋白。而wb转膜敷一抗只显影特异性的蛋白。考染银染基本上用作看IP的全部蛋白作阳性比对。