古老和不均匀的嗅觉受体表达丧失使鲨鱼鼻子成为事实上的犁鼻器官

软骨鱼类以其敏锐的嗅觉而著称，这一特性支持了其大型和复杂的嗅觉器官。研究通过分析嵌合体、鳐、锯鳐和8种鲨鱼的基因组，探讨了四个家族中编码大多数嗅觉化学感觉受体的基因在软骨鱼类中的演化动态。研究结果表明，在软骨鱼类中，假定的OR（嗅觉感觉受体）、TAAR（迷香受体）和V1R/ORA受体的数量相对较少且相对稳定，而假定的V2R/OlfC受体的数量更多且更具动态性。特别是在猫鲨Scyliorhinus canicula中，研究发现许多V2R/OlfC受体以嗅觉受体特有的稀疏分布模式在嗅觉上皮中表达。相比之下，其他三个脊椎动物嗅觉受体家族要么不表达（OR），要么只有一个受体（V1R/ORA和TAAR）。研究还发现，在软骨鱼类的嗅觉器官中，微绒毛嗅觉感觉神经元与泛神经标记物HuC的标记完全重叠，这表明软骨鱼类中V2R/OlfC受体的表达与硬骨鱼类具有相同的细胞类型特异性，即在微绒毛神经元中表达。最后，研究指出软骨鱼类相对于硬骨鱼类具有较少的嗅觉受体数量，这可能是一个古老而持续的演化选择的结果，以提高嗅觉敏感性为代价，降低高度的嗅觉分辨率。这一发现有助于更深入地理解软骨鱼类的嗅觉系统和其在生物进化中的角色。

嗅觉是脊椎动物中许多重要任务的一部分，包括软骨鱼类（如鲨鱼），涵盖了从寻找食物和猎物、繁殖功能和社交互动到避险行为的各个方面。对软骨鱼类（如鲨鱼）以外的脊椎动物，包括硬骨鱼类（如小鼠和斑马鱼）以及无颚鱼（如七鳃鳗）的研究表明，存在四个大的嗅觉受体家族（OR、TAAR、V1R/ORA和V2R/OlfC），它们在嗅觉感觉神经元（OSNs）中表达，并构成了嗅觉检测的分子基础。这些嗅觉受体家族最初在哺乳动物中被发现，但随后的研究表明它们存在于其他四足动物和辐鳍鱼类（硬骨鱼类），以及软骨鱼类，还有无颚鱼，这表明它们存在于所有现存脊椎动物的最近共同祖先中。软骨鱼类（如鲨鱼）的嗅觉器官结构和嗅觉神经元类型。尽管软骨鱼类的嗅觉器官在外观上与一些辐鳍鱼类相似，但其独特之处在于具有称为次级鳃叶的结构，这些次级鳃叶还包含嗅觉上皮。与其他脊椎动物不同，软骨鱼类似乎缺乏纤毛型嗅觉感觉神经元，而主要由微绒毛神经元和少量隐窝神经元组成。最近对软骨鱼类基因组的研究，旨在了解四个嗅觉基因家族在这些物种中的演化动态。研究结果表明，在软骨鱼类中，OR、TAAR和V1R/ORA基因组合规模相对较小且相对稳定，而V2R/OlfC基因组合较大且更具动态性。此外，对猫鲨S. canicula的研究发现，其嗅觉器官中存在少量的OR基因，但TAAR和V1R/ORA家族仅有一个基因表达，而VR2/OlfC基因表现出强烈的多基因表达。综合而言，这些研究有助于更深入地了解软骨鱼类的嗅觉系统，包括嗅觉器官结构和嗅觉神经元类型，以及嗅觉基因在这一脊椎动物类群中的演化和表达方式。这些发现为我们提供了新的视角，有助于揭示软骨鱼类的嗅觉功能和进化

图1. 猫鲨嗅觉器官的形态学。从左到右逐渐增加的分辨率显示了猫鲨嗅觉器官的结构，从整个器官被连接囊（cc）包围开始，到单个鳃叶的一部分。顶行，示意图表示；底行，相同特征的显微照片，标尺如示。显微照片的截面来自原位杂交（ISH）实验。请注意主要鳃叶（p）和次级鳃叶（sl）的存在。感觉表面覆盖了主要和次级鳃叶，但排除了鳃叶顶部（实线），那里富集了黏液细胞（大椭圆形）。一些标记的嗅觉感觉神经元由箭头指出。

实验方法：基因树-物种树调和分析：使用R软件包ape（版本5.0）来折叠在基因系统树中具有低于90%的Bootstrap值的节点。使用Treerecs软件来找到最佳根，并将基因树与物种树进行调和，使用默认参数。

组织准备：组织来自幼年鲨鱼的嗅觉器官，经过甲醛固定处理。组织存储在甲醇中，然后在实验前通过逐渐降低甲醇浓度的方式重新水化。组织在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中三次冲洗，然后在4°C的15%蔗糖溶液中平衡直到下沉。最后，将组织嵌入到Tissue Tek中。

mRNA分离、cDNA合成和RT-PCR：使用easy-spin Total RNA Extraction Kit从嗅觉器官中提取总mRNA。使用SuperScript II Reverse Transcriptase合成cDNA。使用NanoDrop光度计确定cDNA浓度，并将样品存储在-20°C。为每个基因设计正向（Fwd）和反向（Rev）引物，以获得350至560 bp的片段长度。进行RT-PCR，使用介于55°C和58°C之间的退火温度。使用凝胶电泳和测序验证PCR产物。

用于原位杂交的RNA探针生成：通过在反向引物前加入T3启动子序列来生成原位杂交的RNA探针。

原位杂交：制备10μm的横截面冷冻切片。原位杂交在60°C下进行，使用含有甲酰胺、Denhardt's试剂、SSC、酵母RNA和酵母tRNA的混合液。进行强度洗涤以确保探针对各基因的特异性。原位杂交后进行免疫荧光染色。

免疫组织化学（IHC）：使用免疫组织化学，使用特定的抗体，如抗PCNA和抗-HuC抗体。使用携带Alexa Fluor染料的二抗进行荧光检测。使用DAPI作为荧光检测的对比染色。

双标记：结合原位杂交和免疫组织化学进行双标记，允许同时可视化基因表达和蛋白质定位。

图像分析和统计评估：使用ImageJ软件进行图像分析，包括长度、距离测量和细胞计数。计算标记细胞沿片的归一化位置，以及细胞密度。使用Kolmogorov–Smirnov检验（在R软件中实施）来评估两个分布是否显著不同。

Gene Family Dynamics：鲨鱼和硬骨鱼在嗅觉受体基因家族的动态方面存在显著差异。鲨鱼和硬骨鱼中的嗅觉受体基因家族包括OR、TAAR、V1R/ORA和V2R/OlfC四个家族。在鲨鱼中，OR、TAAR和V1R/ORA基因家族的基因数量相对较低且相对稳定，同时几乎没有伪基因和截短基因。与之相反，硬骨鱼中这些基因家族的基因数量通常很大，而且在不同物种之间变化很大，同时这些家族中经常存在大量伪基因。

V2R/OlfC基因家族动态：在鲨鱼中，V2R/OlfC基因家族的基因数量通常较高且变化较大，不同物种可能存在家族扩展。与硬骨鱼类似，鲨鱼中的V2R/OlfC基因家族也经常包括大量伪基因。这表明V2R/OlfC基因家族是多基因家族，编码嗅觉受体，在鲨鱼和硬骨鱼中都可能发生显著的家族扩展和伪基因化。

嗅觉受体基因多样性：鲨鱼中OR、TAAR和V1R/ORA基因家族的多样性相对较低且相对稳定。在这些基因家族中，伪基因和截短基因的存在非常有限。硬骨鱼中，这些基因家族通常显示更高的多样性，不同物种之间差异明显，且存在大量伪基因。总之，这些结论表明鲨鱼的嗅觉受体基因家族相对较为稳定，而硬骨鱼的嗅觉受体基因家族通常更为多样化和动态，这可能与它们的嗅觉适应和环境适应有关。此外，V2R/OlfC基因家族在两者中都显示出显著的扩展和伪基因化。

泛神经标记物HuC：研究使用泛神经标记物HuC来可视化猫鲨嗅觉上皮中的整个神经细胞群。HuC免疫反应性神经元形成了一个几乎连续的不规则单层胞体层，位于上皮的中间层，下面是支持细胞的顶部排列。

增殖细胞：使用增殖细胞核抗原（PCNA）抗体，可可视化构成嗅觉上皮基底层的增殖细胞。HuC和PCNA免疫反应性之间没有重叠，证实增殖细胞与成熟神经元是不同的。

微绒毛标记物TRPC2和Go的表达：该研究检查了两个已知的微绒毛神经标记物，即瞬时受体电位通道TRPC2和G蛋白Go，在由HuC免疫反应性定义的整个神经细胞群中的表达情况。尽管HuC（胞体）和Go（树突和轴突）位于不同的亚细胞区域，但所有HuC-阳性细胞似乎都是Go-阳性。使用HuC抗体和Go原位杂交的双标记实验证实了这一点。此外，TRPC2标记了在硬骨鱼中的所有微绒毛神经元，与HuC免疫反应性完全重叠。未检测到HuC-阳性但TRPC2-阴性或Go-阴性的细胞。

综合来看，（几乎）在猫鲨嗅觉上皮的感觉表面上，所有神经感受器细胞似乎都表达Go和TRPC2，这表明猫鲨的整个感觉神经细胞群都是微绒毛神经元。这与软骨鱼类的嗅觉受体基因家族中V2R/OlfC的占主导地位相吻合，因为在两栖动物和硬骨鱼中，V2R/OlfC受体通常在微绒毛神经元中表达，并且不在纤毛神经元中表达。

比较研究表明，属于OR、TAAR和V1R/ORA家族的嗅觉受体在脊椎动物的演化早期被利用，并存在于现存脊椎动物的最近共同祖先中。尽管V2R/OlfC受体也存在，但它们是在无颚鱼类和有颚脊椎动物分离后才被利用作为嗅觉受体。在硬骨鱼类中，V2R/OlfC相对于OR和TAAR受体较少，但在软骨鱼类中，V2R/OlfC构成整个嗅觉受体谱的基本组成部分（图8）。为什么会有这样的差异？这可能是纤毛型嗅觉感受器细胞的丧失的间接效应，纤毛型嗅觉感受器细胞预计会表达OR和TAAR受体。软骨鱼类嗅觉受体OR和TAAR的稀缺是否等同于对软骨鱼类可感知的气味空间的限制尚待观察。硬骨鱼类鳍条鱼类中OR、TAAR和V2R/OlfC受体数量之间的相关性可能表明这些受体家族之间最初存在功能重叠，而在两栖动物中，它们已经分化进化，用于检测主嗅觉上皮中的挥发性物质和液體触发物质在鼻腔器官中。总的来说，与硬骨鱼类相比，软骨鱼类和无颚鱼类具有较小的嗅觉受体基因库（图8），尽管它们拥有非常发达的嗅觉器官。这些不同的演化轨迹可能是由于在灵敏度和气味辨别之间的不同权衡所致，而软骨鱼类则最大化了对气味的敏感性。在软骨鱼类内部，嗅觉受体数量存在显著差异，这需要进一步研究和了解。例如，刺鳐Amblyraja radiata的OlfC受体可能少于10个，而合鳍鱼C. milii则有40多个OlfC受体，尽管它们消耗相对相似的食物（Froese and Pauly 2022）。进一步的行为和功能研究将有助于更好地理解这个问题。