转导增强剂使靶向CD4和CD8的慢病毒高效递送CAR基因

嵌合抗原受体（CAR）修饰的T细胞在治疗癌症方面效果显著，但制造过程复杂。受体靶向慢病毒载体（LV）选择性地将基因递送到T细胞亚型可能促进和改善CAR-T细胞的产生，但到目前为止，传统LV（水泡性口炎病毒VSV-LV）的基因递送率低。为了改善递送效率低的问题，该文章用转导增强剂Vectofusin-1显著增强CD4和CD8 LV的基因递送，而不会损失靶细胞选择性和所产生的CAR T细胞的杀伤能力。

转导增强剂通过促进载体和细胞的有效共定位来促进载体细胞进入。转导增强剂可以是阳离子聚合物、脂质或肽（如聚布伦、硫酸鱼精蛋白），甚至是小分子。Vectofusin-1，一种富含组氨酸的阳离子两亲性短肽，可促进人CD34造血干细胞与各种假型LV的转导。对于人T和B细胞，使用Vectofusin-1增强了用长臂猿白血病病毒（GALV）包膜蛋白转导，作者研究了Vectofusin-1对CD4-LV和CD8-LV以及VSV-LV和用BaEV糖蛋白（BaEV-LV）假型的LV转导效率的影响，转导第二代CD19-CAR到人类T细胞。截短的低亲和力神经生长因子受体（DLNGFR）作为报告基因。

1. Vectofusin-1提高CAR基因CD4和CD8靶向LV的转导率

靶向CD4-LV和CD8-LV载体设计方案，编码第二代CD19特异性CAR通过P2A切割位点连接的报告蛋白DLNGFR（图1A）。作者用CD4+T细胞和CD8+T细胞做了CD4-LV、CD8-LV、VSV-LV、BaEV-LV的转导增强剂Vectofusin-1的对比实验（图1B）。用流式检测，实验结果表明（1）Vectofusin-1提高了CD4-LV的转导效率且特异性好。（2）Vectofusin-1提高了CD8-LV的转导效率且特异性好。（3）Vectofusin-1降低VSV-LV的转导效率。（4）BaEV-LV自身转导效率最高，加入Vectofusin-1后其效率更高（图1B）。为了研究观察到的Vectofusin-1 效果是否独立于所使用的供体、PBMC激活条件或特定载体批次，在两种不同的PBMC刺激方案下，使用不同的供体并使用两到五个载体进行多次转导（图1C）。用流式细胞术检测，实验结果表明Vectofusin-1显著改善了CD4-LV、CD8-LV和BaEV-LV的转导效率，对VSV-LV有损耗，对载体特异性无影响，BaEV-LV的转导效率最高（图1C）。

图1 Vectofusin-1转导增强剂对不同假分型慢病毒载体CAR基因递送情况

2.Vectofusin-1不影响CAR-T细胞的杀伤能力

作者分析了Vectofusin-1是否影响CAR-T细胞在杀伤CD19阳性肿瘤细胞方面的功能。用CD8-LV转导的CAR-T细胞与羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的CD19阳性Nalm-6细胞按不同比例孵育，做Vectofusin-1的对比实验。通过流式细胞术测定靶细胞裂解。加与不加Vectofusin-1均能够杀死Nalm-6 肿瘤细胞，并且与未转导的T细胞相比，显示出显着更高的杀伤活性。重要的是，使用或不使用Vectofusin-1转导的CAR-T细胞在靶细胞裂解方面没有观察到显着差异。该结果表明Vectofusin-1对CAR-T细胞的细胞毒性没有负面影响（图2）。

图2在加Vectofusin-1产生的CAR-T细胞具有功能

3.DLNGFR在LV颗粒表面并作为蛋白质转移到细胞中

存在与不存在Vectofusin-1，在受体阳性和阴性细胞上都检测到DLNGFR的信号（图3A）。CD4-LV、CD8-LV、VSV-LV使用转导增强剂Vectofusin-1转导CD4+T细胞和CD8+T细胞，检测DLNGFR信号。Vectofusin-1使CD4-LV的非靶细胞的DLNGFR信号显著增加，而靶细胞本身DLNGFR信号可达77%。CD8-LV也观察到了类似的结果。对于VSV-LV，Vectofusin-1使CD4或CD8非靶细胞DLNGFR信号达到所有LV假分型靶细胞的水平。而靶细胞本身的DLNGFR信号很高（图3A）。

DLNGFR阳性细胞的百分比在每个时间点都相似，Vectofosin-1使其总体百分比较高，检测到的DLNGFR阳性T细胞信号强，并随时间略有升高，与CD4和CD8靶细胞的结合效率是相当。没有Vectofosin-1的情况下，同样能观察到以上结果，只是效果不好，并且只与靶细胞结合（图3B）。

图3 Vectofusin-1介导DLNGFR蛋白转移到非靶细胞

为了确定DLNGFR是否结合到载体颗粒中，进行了DLNGFR特异性ELISA。为了定量DLNGFR，使用重组DLNGFR蛋白作为标准。在编码CD19-CAR和DLNGFR作为报告基因的载体颗粒中检测到DLNGFR分子，在编码GFP中没有检测到。DLNGFR分子总量的计算显示每个颗粒有169至350个DLNGFR（表1）。

LV颗粒与非靶细胞的结合是否需要LV假分型的包膜蛋白。为了研究不同包膜成分的作用，用附着蛋白CD4-MV-H和CD8NiV-G，融合蛋白MV-F和NiV-F及LV用转导增强剂Vectofusin-1转导CD4+Tcell和CD8+Tcell，检测DLNGFR信号。结果显示，Vectofusin-1使所有假分型LV的PBMC的颗粒结合以及DLNGFR检测都得到了增强，而对CD4或CD8靶细胞没有任何偏好（图4），并且与CD4-LV和CD8-LV的结合率相当（图3）。不使用Vectofusin-1的情况下，LV、MV-F-LV和NiV-F-LV在细胞结合中效率非常低，而CD4-H-LV和CD8-G-LV仅限靶细胞结合效率高（图4）。结果表明，Vectofusin-1介导的颗粒与细胞的附着独立于所用的包膜蛋白。

图4 DLNGFR在没有包膜糖蛋白的情况下的转移

本文提供的数据表明，转导增强剂Vectofusin-1有促进基于副粘病毒糖蛋白的受体靶向载体将基因转移到T淋巴细胞中。CD4-LV和CD8-LV的转导水平与VSV-LV的转导水平相当。CD4-LV和CD8-LV的转导对各自的T淋巴细胞具有高度选择性。这种高选择性以及递送的CD19-CAR对靶细胞的杀伤没有受到Vectofusin-1的损害。与此一致，它对T细胞表型、生存能力和PBMC增殖能力的影响，只是微不足道的。

由于CD4-LV和CD8-LV的颗粒数与VSV-LV的颗粒数非常相似，不使用Vectofusin-1，它们的转导效率降低是由于与培养细胞膜的低效接触。Vectofusin-1以前被证明可以组装成与病毒颗粒结合的纳米纤维，导致其沉淀，从而增加细胞表面的局部浓度。 Vectofusin1的这种作用可能解释了为什么在向细胞添加病毒30秒后，使用转导增强剂观察到大量与细胞结合的载体颗粒。这种作用与所用的包膜蛋白无关。

DLNGFR不仅经常被用作CAR分子的报告蛋白，而且还被用作其他治疗性转基因的细胞跟踪标记。此外，DLNGFR被用作Vectofusin-1分析载体细胞附着行为的标记，因为它被掺入所有产生的载体的颗粒表面，包括VSV-LV。成为逆转录病毒载体颗粒中的胞质蛋白，如GFP，也是可能的，并负责载体细胞融合后不久的经典蛋白质转移，即所谓的假转导。通过详细的载体细胞结合研究和掺入分析，作者发现转导后不久DLNGFR的存在不是由于经典蛋白质转移。在4℃下将PBMC与载体颗粒共孵育30秒后立即检测到DLNGFR，这表明膜融合介导了DLNGFR从包装细胞转移到PBMC。相反，蛋白质转移是由细胞结合的载体颗粒介导的（图5）。Vectofusin-1增强了这种作用，它延长了载体颗粒与没有膜融合的细胞相关的时间，至少在受体阴性细胞上是这样。

图5 DLNGFR从包装细胞转移到靶细胞和非靶细胞的工作模型

目前应用于CAR-T产生过程中的T细胞纯化步骤比较局限，而靶向CD8和CD4的LV只递送目的基因到靶细胞群，未来可能有助于改善CAR-T细胞的产生，可作为一种有前景的治疗方法。淋巴细胞基因修饰的其他治疗应用也可能受益于靶向淋巴细胞亚群的靶向基因递送。

基恩科生物通过对慢病毒递送系统工艺的不断改进和优化，针对难转导或转导效率低的靶细胞，推出慢病毒转导增强剂，GC-LVreinfircer，转导效率高于Polybreen，并且细胞毒性低，对细胞增殖无影响，可解决部分靶细胞难转导的问题。