RNA-Seq建库原理介绍（smart-seq2）

写在前面

1.RNA-Seq是什么？
RNA测序（RNA-seq）是一种用于研究转录组的工具，转录组是存在于一个或一组细胞中的总RNA分子，包括蛋白质编码RNA（mRNA）和调节或非编码RNA（miRNA、tRNA等）。

2.RNA-Seq有什么用？
1）检测并定量样品的转录组水平
2）检测RNA alternative splicing
3）检测transcript isoform
4）检测gene mutation

3.RNA-Seq实验的基本流程？
所有的RNA-seq实验都遵循类似的方案：
1）从目标样品中分离总RNA（根据要分析的RNA类型，通过设计特定引物类型来富集mRNA，microRNA，lincRNA或保留全部RNA等）
2）逆转录为 cDNA
3）制备测序文库：cDNA片段化、添加测序接头、PCR扩增、文库纯化
4）通过测序平台测序
总之，RNA-seq允许在正常和处理过程中对转录组进行高通量的检测，揭示样品间整体转录组水平的动态变化。

本文将简单介绍RNA-Seq建库策略--Smart-seq2的基本原理

smart-seq2流程.png

1.收集细胞

将细胞处理后（胚胎需去除透明带），置于含有RNA酶抑制剂的细胞裂解中，如果不立即进行实验需置于-80℃保存。（细胞处理过程尽量小于30min，避免细胞状态改变）

2.反转录为cDNA（此方法的独特之处，具体细节请看原文）

通过带有oligo-dT的引物特异的抓取含有polyA尾的mRNA，随后进行反转录，当反转录酶到达RNA的5‘末端时会在反转出来的cDNAD 3'末端额外的添加2-5个碱基C。反转录体系中的TSO（template-swiching oligo）序列凭借其3’末端含有的3个G，会与cDNA互补配对，M-MLV反转录酶能够自动切换模板，并在cDNA的3‘端合成TSO的互补序列。
值得注意的是，由于oligo dT和TSO的5’末端都含有一段相同的人工序列，使得反转得到的每一个全长cDNA在包含转录本序列的同时在其两端都额外增添了一段相同的人工序列，在这种情况下，后续的PCR扩增只需要引入当个引物即可完成。

3.PCR预扩增与纯化

由于smart-seq2主要应用于低起始量的生物学样本，所以需要进行对cDNA进行预先的PCR扩增以便完成后续的步骤。通常>1ng的DNA量就可以继续后续步骤，因此我们需要根据特定的样品来确定预扩增的循环数。在完成PCR扩增后，我们会使用磁珠（AMPure XP）特异的抓取DNA片段，以达到纯化的目的。

4.DNA片段化（Tagmentation）+ 添加接头序列

DNA片段化比较常见的方式有超声打断和酶切打断。超声打断的步骤相对较复杂且费时（有空再介绍了）

Tn5工作过程.png

在这个步骤中，smart-seq2中采用经过处理的Tn5转座酶衍生物（故名思意，转座酶是一种能够将识别DNA片段（转座子）两端的特异序列，将DNA片段（转座子）从原来的位点脱离或拷贝出来，再插入新的DNA靶位点中的酶）。该衍生物可以在片段化DNA的同时在其两端加上接头序列（adaptor）。

放大的tn5.png

在Tn5二聚体里面的双链Oligo是一段包含19个碱基的Tn5 binding site。伸出来的单链序列称为接头序列，可以与下一步的测序引物（sequencing primer）互补配对。

5.PCR富集扩增与纯化（illumina）

片段化DNA后，我们需要进一步扩增DNA序列以达到后续上机测序所要求的最低浓度。另外，在这个步骤中，我们需要在上一步得到的DNA片段两端加上测序引物（sequencing primer）。从上面的图中我们可以看到测序引物由三段序列构成，与测序平台引物互补的序列，标记样品的index序列，以及与adaptor互补的序列。
经过上述的所有步骤后，我们就得到了最终用于上机测序的DNA文库，其片段大小通常在200-600bp之间
。

如果有问题的话，可以结合下一篇illumina的测序原理介绍

参考文献

1. Picelli S, Faridani OR, Björklund AK, Winberg G, Sagasser S, Sandberg R. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 2014;9(1):171-181. doi:10.1038/nprot.2014.006
2. https://v4.cecdn.yun300.cn/100001_2005205005%2FTR501-TR503%EF%BC%88%E5%8D%95%E9%A1%B5%EF%BC%89V22.1.pdf