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一、研究背景

1. 结直肠癌的流行病学和免疫治疗现状

结直肠癌（CRC）是最常见的癌症之一，死亡率高局前三，并且转移性CRC的预后仍然较差。通过针对T细胞抑制分子如PD1和CTLA-4的靶向治疗，可以在具有微卫星不稳定性高（MSI-H）或DNA错配修复缺陷（dMMR）的高突变肿瘤中诱导T细胞介导的抗肿瘤免疫，取得显著的疗效。然而仅5%的CRC患者对ICB阻断治疗敏感，如何提高CRC患者的免疫反应性仍然是CRC肿瘤免疫研究的重点方向。

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2. KRAS突变是CRC发生发展的驱动因素之一，与CRC免疫细胞浸润减少有关

研究表明，约45%CRC存在KRAS突变，目前尚未有临床上验证有效的小分子抑制剂能通过抑制KRAS活化治疗CRC。在基于基因表达的共识分子亚型（consensus molecular subtypes, CMS）分型中，与CMS1亚型CRC相比，存在KRAS突变的CMS2和CMS3亚型，肿瘤微环境中免疫细胞浸润明显减少。此外，KRAS突变CRC小鼠模型存在抑制性免疫微环境和对PD1抗体治疗不敏感等表型，提示突变的KRAS可通过抑制抗肿瘤免疫应答促进CRC进展。

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3. 谷氨酸通道蛋白SLC25A22在KRAS突变CRC中促进肿瘤进展

SLC25A22是线粒体转运蛋白家族（SLC25）的成员之一，它在内线粒体膜上促进谷氨酸的转运进入线粒体基质中。作者既往研究表明，SLC25A22在KRAS突变型结直肠癌中起着致癌因子的作用，生成对抗氧化应激和表观遗传调控至关重要的代谢物。但SLC25A22是否参与KRAS突变介导的抑制性免疫微环境尚不明确。

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二、拟解决的科学问题

① 研究中所使用的SLC25A22作为KRAS突变的结直肠癌免疫治疗靶点。你可以提出关于SLC25A22的功能、表达和调控机制的问题。（既往研究已解答）
② KRAS的介导免疫抑制如何影响免疫细胞的功能？（是否上调MDSC浸润，下调CD4/8+ T细胞浸润等？）
③ SLC25A22敲除如何影响KRAS介导的免疫抑制？（SLC25A22敲除是否能够逆转KRAS介导的免疫抑制以及如何影响MDSC招募和细胞毒性T细胞激活？）
④ 在KRAS突变结直肠癌中，SLC25A22作为治疗靶点是否有助于提高对ICB治疗的反应？（SLC25A22 siRNA与抗-PD1联合治疗是否协同作用以及如何抑制肿瘤生长？）

三、目的和意义

本研究探讨SLC25A22作为改善KRAS突变CRC患者对免疫检查点阻断治疗反应的潜在治疗靶点，有助于临床进一步开发增强 KRAS突变CRC免疫治疗反应的药物组合，提高KRAS突变CRC的预后。

四、研究内容和结果

1. KRAS突变促进了免疫抑制（ApcMin/+KrasG12D/+Villin-Cre基因工程小鼠表型）

S1. 显示APC-KRAS突变小鼠（ApcMin/+KrasG12D/+Villin-Cre）的中位生存期为45天，具有较高的死亡率（P < 0.0001）。
a. 显示在45天时，野生型或KRAS突变小鼠没有肿瘤；APC突变小鼠和APC-KRAS突变小鼠的结肠中分别有1.4 ± 0.7和18.0 ± 8.4个肿瘤。
b. 显示APC-KRAS突变小鼠结肠肿瘤中富集了多个与免疫反应相关的信号通路，包括TNF和细胞因子-细胞因子受体通路。
c. 使用流式细胞术分析显示，APC-KRAS突变肿瘤中MDSCs（CD11b+Gr1+，尤其是多核粒细胞型MDSCs）显著增加（P < 0.01），同时总T细胞和CD8+ T细胞受到抑制（P < 0.05）。CD4+ T细胞和巨噬细胞未受影响。

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2. SLC25A22基因敲除可以逆转KRAS引起的免疫抑制

2.1 ApcMin/+KrasG12D/+Villin-Cre基因工程小鼠原位瘤类器官模型

2.2 鼠源性肠癌肿瘤细胞系CT26皮下种植瘤模型

2.3 ApcMin/+KrasG12D/+Slc25a22fl/fl Villin-Cre基因工程小鼠模型

d. 展示了APC-KRAS-SLC25A22 KO肿瘤与APC-KRAS突变肿瘤的生长对比，显示APC-KRAS-SLC25A22KO肿瘤生长受阻。
e. 使用流式细胞术分析显示，APC-KRAS-SLC25A22 KO肿瘤中的总MDSC和PMN-MDSC的含量降低（P < 0.05），而总T细胞（P < 0.05）和CD8+ T细胞（P < 0.05）的含量增加。
f. Slc25a22基因敲除的CT26瘤的体积较小。
g. 使用流式细胞术分析显示，Slc-KO CT26瘤中的MDSC（P < 0.01）和PMN-MDSC（P < 0.01）的含量降低，而总T细胞和CD8+ T细胞的含量增加（P < 0.01）。

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h. APC-KRAS-SLC25A22 KO转基因小鼠中，MDSC（Cd11b+Gr-1+）被消耗（P<0.01），并通过IF染色和IHC染色（S100a8）进行了证实；同时，CD8+T细胞被诱导（P<0.05），从而验证了我们CT26皮下种植瘤中的观察结果。

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2.4. SLC25A22敲除逆转突变KRAS结肠癌细胞诱导的人源化PBMC小鼠免疫抑制作用。

图2b显示，SLC25A22基因敲除（SLC-KO）会导致肿瘤生长受到抑制（P < 0.001），并且减轻肿瘤重量（P < 0.01）。肿瘤浸润的huCD45+免疫细胞的分析验证了人源衍生的髓系抑制细胞（HLA-DR-CD11b+CD33+）的减少，同时看到CD8+ T细胞的增加（图2c和S3）。这证实了SLC25A22对KRAS突变结肠直肠癌中人源CD45+免疫细胞浸润的影响。
图2d显示，SLC25A22高表达的病例中有更多的CD33阳性细胞浸润。在KRAS突变型CRC中，SLC25A22的表达与CD33阳性细胞呈正相关（P < 0.05），但在KRAS野生型CRC中无相关性。因此，在SLC25A22高表达的KRAS突变型CRC中，MDSC水平较高（P < 0.01），而在KRAS野生型CRC中无显著差异。
图2e显示，使用TCGA数据构建了一个基于MDSC的评分系统。在KRAS突变型CRC中，MDSC高表达组SLC25A22的mRNA水平较高，而在KRAS野生型CRC中无明显差异。
图2f, 2g通过免疫组织化学（IHC）分析临床队列（N = 202）中SLC25A22与CD8标记的相关性。通过比较KRAS野生型和突变型CRC，发现KRAS突变型CRC组织中CD8低表达的比例更高，提示存在免疫抑制现象。值得注意的是，SLC25A22高表达的CRC与SLC25A22低表达的CRC相比，CD8评分更低（P < 0.001）。整体队列（χ2 = 13.8；P < 0.01）或KRAS突变型CRC（χ2 = 6.6；P < 0.05）中均发现CD8评分与SLC25A22呈负相关。综上所述，SLC25A22与KRAS突变型CRC中的免疫抑制表型相关。

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3. SLC25A22敲除抑制KRAS突变介导的CXCL1/3趋化因子通路

3.1 生信分析

3.2 转录水平验证

3.3 蛋白水平验证

3.4 细胞因子分泌水平验证（包括细胞上清、动物模型血清）

3.5 TCGA数据库验证

图3a, b, c生信分析指出cytokine-cytokine receptor interaction是SLC25A22敲除细胞显著抑制的信号通路。

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图3d炎症因子qPCR芯片结果显示APC-KRAS小鼠肿瘤组织中CXCL1、CXCL3和IL1B的表达较癌旁组织升高，而DLD1和CT26细胞中SLC25A22敲除表现为降低。图3e通过qPCR验证了SLC25A22敲除后在KRAS突变结肠癌细胞（DLD1、Colo26、CT26）中下调的CXCL1/3。图3f, g抗体蛋白芯片分析显示在DLD1-sgControl和DLD1-SLC-KO细胞的培养基中分泌的细胞因子，结果也提示SLC25A22敲除细胞中CXCL1和CXCL1/2/3的分泌减少。最后，图3h通过ELISA验证了SLC25A22敲除后DLD1、CT26和Colo26细胞中CXCL1/3的分泌下降。

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图S5显示，与APC-KRAS器官样本相比，APC-KRAS-SLC25A22KO器官样本中的CXCL1分泌也受到抑制。为了验证SLC25A22是否调节体内的CXCL1/3水平，图3i评估了APC-KRAS器官样本移植和CT26移植模型中的血清和肿瘤中的CXCL1/3水平。在CT26移植模型中，SLC25A22基因敲除降低了血清中的CXCL1水平（P < 0.05）和肿瘤中的CXCL1水平（P < 0.001），而仅在肿瘤中下调了CXCL3水平（P < 0.01）。APC-KRAS-SLC25A22KO器官样本植入的小鼠显示血清中CXCL1的减少，而肿瘤中的CXCL1/3水平与APC-KRAS器官样本相比显著降低（P < 0.001）。
图3j使用TCGA数据库验证，也提示CXCL1/3是与SLC25A22 mRNA表达显著相关的前两个细胞因子（P < 0.0001）。

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4. SLC25A22通过CXCL1-CXCR2轴调节骨髓来源抑制性免疫细胞（MDSC）的招募，并促进MDSC的活化

①体外实验验证SLC25A22敲低抑制MDSC趋化的作用

图4a（方法学示意图）：分离出的小鼠脾脏MDSC和人类PBMC移植小鼠脾脏中的人类MDSC用于趋化实验。图4b对比具有或不具有SLC25A22敲低CRC细胞的培养基，对MDSC迁移的影响。结果表明，对照组细胞的培养基促进了MDSC的迁移，而SLC25A22缺失细胞的培养基则减弱了这种促进作用。

②使用MDSC标志物阐明SLC25A22敲低抑制MDSC趋化的作用

图4h比较CT26-sgControl和SLC25A22敲除的CT26肿瘤中MDSC标记物的表达水平。图4i通过流式细胞术验证了SLC25A22敲除对CT26肿瘤中MDSC表面PD-L1蛋白的影响。

③体内实验验证SLC25A22敲除抑制MDSC趋化与CXCL1水平降低相关

3种体内模型中肿瘤CXCL1和MDSC的相关性

④体外实验验证CXCL1-CXCR2轴对MDSC的趋化作用
⑤体外反向实验 说明SLC25A22敲低抑制MDSC趋化的作用与CXCL1-CXCR2轴有关

图4c展示了在DLD1细胞中敲除CXCL1/3后，MDSC迁移的变化。结果表明，CXCL1-siRNA抑制了MDSC在DLD1-sgControl细胞的培养基中的迁移，而CXCL3-siRNA没有影响。图4d显示抗CXCL1抗体是否影响MDSC迁移。结果表明，抗CXCL1抗体阻断了CT26-sgControl和Colo26-sgControl细胞培养基中的MDSC迁移，但在SLC-KO细胞培养基中无效。图4e. 添加外源性的CXCL1促进MDSC在CT26-Slc-KO和Colo26-Slc-KO细胞培养基中的迁移。图4f：显示CXCR2抑制剂对DLD1-sgControl和CT26-sgControl细胞培养基中MDSC迁移的影响。

⑥体内反向实验 验证CXCL1-CXCR2轴的作用

图4j显示通过给予SB265610来阻断CXCR2是否会调节SLC25A22介导的KRAS突变型CRC的生长。图4k：展示SB265610是否能抑制控制组中MDSC浸润，但对SLC25A22敲除组无效，并且肿瘤中的MDSC与瘤负荷呈正相关关系。

5. SLC25A22通过促进MDSC浸润，抑制CD8+ T细胞的抗肿瘤活性

①来自SLC25A22敲除小鼠的MDSC相比对照组，对T细胞增殖的抑制能力减弱

图5a为体外T细胞/MDSC共培养示意图。图5b比较来自SLC25A22敲除肿瘤的MDSC相比对照组在抑制CD8+ T细胞增殖方面的差异。

图5d体内实验使用MDSC与CD8+ T细胞的负相关关系说明SLC25A22敲除逆转KRAS突变肿瘤中CD8+ T细胞数量减少

②使用CD8+ T细胞的功能标记物IFN-γ、TNF-α和Granzyme B阐明SLC25A22敲除逆转KRAS突变肿瘤中CD8+ T细胞活性降低

图5c体外实验

图5e, 5f体内实验

③体内反向实验 消耗CD8+ T细胞，反向验证了SLC25A22敲除对CD8+ T细胞驱动的抗肿瘤免疫中的功能

图5g：展示了通过抗CD8抗体消耗CD8+ T细胞，使SLC25A22敲除对CT26异种移植物的生长抑制效应消失的结果

小结：SLC25A22通过CXCL1-CXCR2轴促进骨髓源性免疫抑制细胞趋化，抑制肿瘤微环境中CD8+ T细胞数量和功能，从而参与KRAS突变免疫抑制性微环境的形成。SLC25A22调控CXCL1水平的分子机制是什么？
背景：SLC25A22 (glutamate carrier 1 (GC1))是谷氨酸通道蛋白，主要将线粒体外谷氨酸转运到线粒体内生成α-酮戊二酸（α-KG）参与三羧酸循环，与谷氨酰胺能量代谢有关。

Glutamine metabolism: from proliferating cells to cardiomyocytes,
Metabolism, Volume 121, 2021

科学问题：SLC25A22调控CXCL1水平是否谷氨酰胺依赖？（是否通过谷氨酰胺代谢重编程调控CXCL1表达？）

6. SLC25A22通过调节谷氨酰胺代谢产生的天冬酰胺促进CXCL1生成

①KRAS突变肠癌细胞中，谷氨酰胺的增加可以促进CXCL1的分泌，而SLC25A22的缺失在高浓度谷氨酸下会导致CXCL1的mRNA水平和分泌受到抑制

图6a使用qPCR明确谷氨酰胺浓度依赖性促进CXCL1表达，SLC25A22敲低则逆转该现象；图6b使用培养基上清ELISA验证该现象

②使用GDH抑制剂抑制谷氨酸转化为α-酮戊二酸不能降低CXCL1表达，而使用天冬氨酸转氨酶（aminotransferase）抑制剂同时抑制α-酮戊二酸和天冬氨酸生成，能有效下调CXCL1表达，提示KRAS突变肠癌细胞中，谷氨酰胺的增加可以促进CXCL1的分泌可能与天冬氨酸有关
GDH：谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase 1, GLUD），谷氨酸→α-酮戊二酸，抑制剂为R162和Purpurin
AAT：天冬氨酸转氨酶（aminotransferase），谷氨酸-草酰乙酸→α-酮戊二酸-天冬氨酸，抑制剂为AOA

图6c：

线粒体内谷氨酸转化为α-酮戊二酸的关键酶，Glutamate metabolism and recycling at the excitatory synapse in health and neurodegeneration. Neuropharmacology. 2021 Sep 15;196:108719.

图6d

③补充天冬酰胺可以恢复SLC25A22敲低的KRAS突变肠癌细胞的CXCL1表达和分泌

提示只有天冬氨酸可以恢复CXCL1的mRNA水平，其他代谢产物无法实现这一效果；在SLC25A22敲除的细胞中，外源表达SLC1A3可以增加天冬氨酸的摄取，并恢复CXCL1的表达。

④同位素标记谷氨酰胺代谢物检测，明确SLC25A22敲低下调谷氨酰胺代谢产生的天冬酰胺水平

图6g

⑤补充天冬酰胺逆转SLC25A22敲低对MDSC趋化的抑制作用

图6h

⑥反向实验：天冬酰胺合成酶（ASNS）基因沉默或天冬酰胺酶（ASNase）处理来耗竭天冬酰胺，可以下调CXCL1表达和分泌，抑制MDSC趋化作用

图6i显示天冬酰胺合成酶（ASNS）基因沉默降低谷氨酰胺生成天冬酰胺的量, 图6j显示天冬酰胺酶（ASNase）消耗天冬酰胺的效果；图6k, 6l, 6m分别为CXCL1表达、分泌和MDSC趋化实验

小结：KRAS突变结肠癌中高表达的SLC25A22调控CXCL1水平依赖谷氨酰胺代谢产生的天冬酰胺浓度改变。
背景：既往研究表明KRAS突变与肿瘤代谢重编程关系密切，如上调谷氨酰胺进入TCA循环、丝氨酸一碳代谢途径等，通过增强氧化磷酸化水平、甲基化水平、NADPH和GSH水平等，改善KRAS突变肿瘤细胞的能量代谢和抗氧化应激能力，从而促进肿瘤发生发展。

Metabolic networks in mutant KRAS-driven tumours: tissue specificities and the microenvironment. Nat Rev Cancer. 2021 Aug;21(8):510-525.

The Metabolic Landscape of RAS-Driven Cancers from biology to therapy. Nat Cancer. 2021 Mar;2(3):271-283.

科学问题：天冬酰胺浓度如何驱动CXCL1的表达？（是否通过改变相关转录因子的磷酸化水平调控CXCL1表达？）

7. SLC25A22作用下增加的天冬酰胺水平通过上调SRC磷酸化促进转录因子ETS2活化，驱动CXCL1表达

①天冬酰胺促进SRC磷酸化 （图7c存在添加谷氨酰胺或天冬酰胺上调SRC总蛋白水平，且未做phos-SRC/total-SRC比值的统计分析，证据欠佳，但同时提示了天冬酰胺上调SRC磷酸化水平可能与稳定SRC蛋白、抑制蛋白降解有关？）

图7a使用磷酸化蛋白芯片检测天冬氨酸处理0.5h后发生磷酸化改变的激酶。图7b体外验证SLC25A22敲低抑制SRC磷酸化。图7c添加谷氨酰胺或天冬酰胺能逆转SLC25A22敲低对SRC磷酸化的抑制作用

②天冬酰胺可能通过结合的方式增强SRC蛋白稳定性，并上调SRC激酶活性

图7d显示天冬氨酸增加了重组SRC的热稳定性，图7e显示天冬氨酸与SRC可以通过结合亲和力（Kd）为21 µM而发生相互作用。此外，图7f显示天冬氨酸诱导了重组SRC蛋白的磷酸化和激酶活性。相比之下，图S12显示D-天冬酰胺无法与SRC结合或激活。

③明确天冬酰胺依赖的SRC磷酸化上调通过促进转录因子ETS2活化，驱动CXCL1表达
④阐明ETS2与CXCL1启动子结合，促进CXCL1转录

图7g通过对CXCL1启动子预测分析、受SRC调控的转录因子数据集和SLC25A22敲低的RNA seq结果取交集，发现ETS2是一个潜在的转录因子，能将SLC25A22与CXCL1连接起来。图7h在DLD1和CT26细胞中验证SLC25A22的基因沉默抑制了ETS2和p-ETS2（活性形式）水平。图7i在DLD1和CT26细胞中发现SLC25A22的基因沉默抑制了ETS2的核转位。图7j使用谷氨酰胺或天冬酰胺均能逆转SLC25A22沉默的作用，上调ETS2蛋白水平。图7k使用siRNA沉默天冬酰胺合成酶（ASNS）表达，反向验证了ETS2对天冬酰胺水平的响应。图7l通过敲低ETS2表达反向验证ETS2驱动CXCL1表达。图7m过表达ETS2正向验证ETS2上调CXCL1表达。图7n使用ChIP-PCR和Southern Blot明确ETS2与CXCL1启动子多个motif结合。图7o通过荧光素酶报告基因试验确定ETS2可激活CXCL1启动子。图7使用pSRC抑制剂能下调DLD1细胞中p-ETS2、ETS2和CXCL1蛋白水平，证明SRC作为天冬酰胺感受器在SLC25A22下游调控ETS2/CXCL1轴。

8. SLC25A22敲除使KRAS突变型结直肠癌对免疫检查点抑制疗法更敏感

图8分别在CT26-KrasG1D和MC38-KrasG12V异种移植瘤模型验证SLC25A22敲除协同PD1单抗对肿瘤的抑制效果，图8c和图8d的流式细胞术结果显示，SLC25A22敲除加上抗PD1疗法协同作用降低了髓系-抑制细胞（MDSC）的数量，并促进细胞毒性CD8+ T细胞的浸润和IFN-γ的表达。

图8e使用siSLC25A22纳米颗粒（VNP）与抗PD1的联合治疗协同抑制髓系-抑制细胞（MDSC）的数量，并促进细胞毒性CD8+ T细胞的浸润和IFN-γ的表达，从而抑制MC38-Kras G12V 种植瘤的生长。

五、总结

1. KRAS突变是CRC的驱动因素，并且与免疫浸润的减少有关。
2. 靶向SLC25A22（siRNA纳米颗粒沉默表达）通过减少天冬酰胺生成，下调SRC-ERT2轴活性，抑制CXCL1表达，从而减少髓系来源抑制细胞（MDSC）并增加CD8+ T细胞，联合PD1抗体可有效抑制KRAS突变CRC进展。

总结图

六、优缺点

1. 临床意义：SLC25A22作为潜在的治疗靶点，用于改善KRAS突变CRC患者对免疫检查点阻断治疗的反应。（KRAS突变作为CRC的驱动因素，并与降低的免疫浸润相关联。其次，针对PD1和CTLA-4等T细胞抑制分子的靶向治疗在具有高突变肿瘤的CRC患者的小部分人中显示出疗效，凸显了改善CRC对免疫检查点阻断治疗反应的需求。）
2. 可参考方法学：构建人源化PBMC肿瘤免疫细胞浸润模型、使用类器官构建同种移植瘤模型（有利于使用基因工程鼠进行体外实验）、脾脏免疫细胞分离培养及趋化实验等
3. 前言可参考：相关KRAS突变与抑制性免疫微环境关系的说法和文献来源（见汇报的背景部分）
4. 瑕疵：①图8的siRNA纳米颗粒应为VNP，图内标为LNP。②对于为什么研究MDSC，为什么使用磷酸化蛋白芯片等没有进行讨论分析。③缺乏临床证据：如关于SLC25A22在结直肠癌患者组织芯片验证和抑制性免疫微环境的相关性分析。