雌二醇 E2 诱导的表观遗传机制及基因表达调控
性腺激素17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）的受体通过与基因组中的雌激素反应元件结合，成为基因转录的关键调节因子。除了经典的基因组作用外，E2通过修饰DNA和组蛋白上的表观遗传标记来调节基因转录。根据反应组分的不同，雌激素受体（estrogen receptor，ER）会促进启动子或增强子区域的DNA甲基化。ER是被动和主动DNA去甲基化的重要调节因子。此外，ER与不同的组蛋白修饰酶和染色质重塑复合物合作改变基因转录。在这篇综述中，我们总结了雌激素受体与DNA甲基化、去甲基化和组蛋白修饰过程以及染色质重塑复合物之间的基本机制和相互作用；还讨论了这些机制与记忆形成、胚胎发育、精子发生和衰老的生理过程以及癌症发生的病理生理变化的特殊相关性。
Introduction
表观遗传学可以简单地定义为“在DNA序列不发生变化的情况下发生的基因组功能的可遗传变化”。Epigenesis一词来自希腊语前缀“epi”，意思是“结束”，epigenetic则意味着所有遗传学研究和所有不同类型的DNA有关工作。主要的表观遗传变化是 DNA 胞嘧啶甲基化； 甲基化胞嘧啶残基的羟基化(5hmC)；以及翻译后组蛋白修饰，例如乙酰化、羟基化、磷酸化和泛素化。DNA 和组蛋白修饰在表观遗传中发挥着至关重要的作用。 尽管染色质重塑通常不会遗传，但它通过改变染色质与转录复合物的可及性来影响基因转录，从而导致细胞表型的变化。此外，长非编码、小干扰或微小RNA以及染色质构象的变化也在表观遗传机制中发挥作用。
E2广泛地影响生物现象，从生育能力到记忆形成。E2与细胞内雌激素受体（estrogen receptors，ERα、ERβ）的配体结合域（E-domain）结合。配体结合后，ERα和ERβ形成同源二聚体（homodimer）和异源二聚体（heterodimer）。二聚化的ERs作为配体激活的转录因子，与 DNA 上的雌激素反应元件 (estrogen responsive elements，EREs) 相互作用，进而诱导或抑制基因转录。除了对 EREs 的经典基因组作用外，ERs 还通过甲基化转录因子结合位点（基因组中富含胞嘧啶和鸟嘌呤的区域，即启动子或增强子区域中的 CpG 岛）来改变基因表达。E2介导的生物学过程能够主动乙酰化或甲基化组蛋白。有趣的是，E2是DNA和组蛋白上被动和主动DNA去甲基化过程的关键成分。此外，E2能够通过重塑染色质可及性来调节染色质的结构。
尽管知识相对有限，但我们试图强调最近获得的关于E2在表观遗传机制和潜在后果中的作用。因此，在这篇综述中，我们的首要目标是描述E2诱导的DNA和CpG岛甲基化以及去甲基化过程；我们还讨论ERs如何与组蛋白修饰酶和染色质重塑复合物相互作用。最后，将总结E2诱导表观遗传改变的生理和病理生理学相关性。
1. E2通过DNA甲基化改变基因转录
为了理解E2诱导甲基化的机制，我们首先讨论CpG岛的作用。 在甲基化过程中，在 DNA 甲基转移酶 (DNMTs) 的催化下，甲基从 S-腺苷甲硫氨酸 (SAM) 转移到胞嘧啶残基的 5`-C 上，从而在 CpG 岛中形成 5-甲基胞嘧啶(5mC)。 有两种功能不同的 DNMTs（DNMT1、DNMT3）。 DNMT1 在 DNA 复制过程中活跃，从亲本 DNA 链复制 DNA 甲基化模式。DNMT3，即所谓的从头甲基转移酶，具有三种不同的亚型：DNMT3a、DNMT3b和DNMT3l。DNMT3a 和 DNMT3b 在未修饰的 DNA 上建立新的甲基化模式。相比之下，DNMT3I 不与 DNA 结合，而是与其他 DNMT3 蛋白形成复合物，甲基化胞嘧啶并刺激其活性。 CpG 岛是典型的甲基化位点，具有约 1000 bp 进化保守的 DNA 片段和调节基因表达及染色质结构的启动子区域。重要的是，CpG 岛的表观遗传修饰改变了基因表达模式。 当甲基化发生在基因的启动子区域或转录结合位点时，它会抑制转录活性。然而，由于甲基化具有位点特异性效应，其机制更为复杂。 虽然甲基化会阻断转录起始位点的转录，但它会促进基因体中的转录。
E2 所引发的表观遗传变化，包括 CpG 岛的甲基化。一般来说，ERs 与细胞核中的雌激素反应元件 (EREs) 结合并诱导基因转录。 但在乳腺癌中，ERs结合位点DNA的甲基化状态与ERα活性密切相关(10.4161/epi.27688)。 例如，Marques 及其同事证明 ERα 甲基化 CYP1A1 位点，并且 ERα 通过 CpG 岛的甲基化导致孕酮受体、环氧化物水解酶2 (Ephx2)、脂质运载蛋白2 (LCN2) 和干扰素α诱导蛋白27 (IFI27) 基因的沉默。 总而言之，这些结果表明配体 ERs 的功能涉及 CpG 启动子的甲基化和基因沉默。
多项实验表明E2改变了 DNMTs 的 mRNA 和蛋白质表达。最近的一篇论文展示了转录因子OCT4和ERα在 ERE 介导的 DNMT1 表达中的重要性(10.1111/cpr.12612)。OCT4在ERα阳性乳腺癌中不会促进DNMT1的表达，因为ERα占据了DNMT1启动子区的ERE序列并抑制DNMT1的表达。 将E2显微注射到背侧海马后，海马DNMT3a和DNMT3b mRNA表达和蛋白水平增加，但DNMT1表达没有改变(10.1523/JNEUROSCI.5819-11.2012)。 Li 及其同事证明，ERα 阳性MCF7 细胞中 DNMT3b 蛋白水平因 E2 刺激而升高(10.2147/OTT.S208988)。 此外，E2刺激还激活了MCF7细胞中的DNMT3b，并使核糖体蛋白激酶 (RSK4) 的启动子区域甲基化。 这些结果表明E2 刺激确实增加了 DNMT3b 表达。由于 DNMT3b 是一种从头甲基转移酶，这些结果还表明 ERα 在 DNA 甲基化的从头形成中发挥作用，并通过 DNMT 介导的 DNA 甲基化改变转录的起始。
从机制上看，E2是间接激活 DNMT3b 的功能，因为 ERs 本身不与任何 DNMT 酶结合。首先，ERα 招募协同调节因子，例如核受体相互作用蛋白 (NRIP1)、雌激素活性阻遏物 (REA，是一种突变型雌激素受体) 以及转移相关因子（MTA1、MTA3）。该复合物随后招募额外的共阻遏物，例如组蛋白脱乙酰酶 (HDAC1) 和多梳复合物2 (PRC2)。HDAC 和 EZH2（PRC2 的酶活部分）首先使激活组蛋白标记去乙酰化，然后在启动子核小体中组蛋白的赖氨酸残基上放置一个抑制性的甲基。即使 ERα 可以抑制 HDAC 的表达，但 E2 可以诱导大鼠乳腺中 EZH2 基因的表达。该复合物以两种方式激活 DNMT3。其一，CpG岛附近的H3K27或H3K36的三甲基化激活DNMT3a和DNMT3b。其二，包含 EZH2 和 NurD 的 PRC2 复合物与DNA 甲基转移酶复合物（DNMT3a、DNMT3b、DNMT3l）结合，然后 DNMTs 甲基化 CpG 岛。 总之，ERα通过影响组蛋白和CpG岛中胞嘧啶残基的甲基化状态在基因转录调控中发挥作用。 ERα 在甲基化过程中招募共阻遏物（HDAC1、PRC2）和不同的蛋白质复合物（PRC2、NurD）。 ERα、共阻遏物和不同蛋白质复合物之间的相互作用导致 ERE 中的 CpG 岛甲基化。仅 DNMT 激活是不够的，需要组蛋白甲基化和染色质重塑来阻断基因转录（图 1）。
2. E2 通过 ERs 诱导去甲基化
在去甲基化过程中，CpG岛失去甲基，从而导致基因转录的启动。 与DNA 甲基化相比，去甲基化是一种更复杂的机制。CpG 岛的 DNA 去甲基化过程可以是被动的、主动的或两者的组合。当新复制的 DNA 链缺乏甲基化信号时，就会发生被动 DNA 去甲基化。在正常细胞功能期间，当 DNMT1 未能在新合成的菌株上放置甲基时，就会发生被动去甲基化。在正常细胞功能期间，只有当 DNMT1 的功能被阻断时才会发生被动去甲基化。与被动过程相比，5mC在主动去甲基化过程中经历了非常复杂的化学修饰。5mC 可以通过两种不同的方式进行修改。第一种方法是通过 10-11 易位酶（TET：TET1、TET2、TET3）将 5mC 氧化为 5hmC。TET2 与其他两个 TET 不同，因为它缺少 DNA 结合域。5hmC 进一步氧化为 5-甲酰基-胞嘧啶 (5fmC)，然后氧化为 5-羧基-胞嘧啶 (5caC)。5mC残基修改的另一种方法是使用激活诱导的胞苷脱氨酶/载脂蛋白B mRNA 编辑酶 (AID/APOBEC) 介导的脱氨作用。AID/APOBEC 使 5mC 脱氨基形成 5-羟甲基-尿嘧啶 (5hmU)。TET 和 AID/APOBEC 引发的修饰由碱基切除复合物 (BER) 识别和修复，该复合物用裸露的胞嘧啶替换被修饰的胞嘧啶残基。 胸腺嘧啶 DNA 糖基化酶 (TDG) 是该复合物的另一个主要成分，对于主动 DNA 去甲基化的最后一步至关重要(10.1126/science.1210944)。 TDG 酶去除修饰的胸腺嘧啶、5hmU、5fmC 和 5caC，并用胞嘧啶取代它们(10.1038/nature12750)。
先前的研究表明，乳腺癌中的 CpG 岛在 EREs 中更有可能去甲基化。 大量证据表明，E2 通过基因组中启动子或增强子区域的去甲基化来诱导基因表达(10.4161/epi.27688, 10.3390/molecules23102543)。ERα 通过 ERE 介导的 DNMT1 表达抑制在被动去甲基化中发挥作用。 虽然配体的ERα与DNMT1启动子中的ERE结合，但它并不启动基因转录，而是抑制其他转录因子启动DNMT1的基因表达。
除了 CpG 岛的被动去甲基化之外，E2 还以两种不同的方式诱导主动去甲基化。 第一种方式是通过 TET 酶介导的。ERα 通过与启动子区域的 ERE 序列结合并与 TET2 和 BER 形成复合物，专门激活 TET2 的表达(10.1126/sciadv.aau6986)。甲基被修饰后，BER 复合物通过 TDG（BER 的酶促部分）和 p300（组蛋白乙酰转移酶，E1A相关蛋白）将其替换为裸露的胞嘧啶残基。 在 BER 复合体中，p300 和 TDG 与 ERα 相互作用(10.1186/s13072-018-0176-2)，用裸露的胞嘧啶取代5hmC 并促进基因表达。此外，E2还激活ERE区域中CXXC4和CXXC5等锌指蛋白的表达(10.1038/srep37808)。 CXXC 蛋白与细胞核中的 TET2 相互作用并使胞嘧啶残基去甲基化(10.1038/srep37808)。通过激活 TET2 酶和 CXXC4/CXXC5，E2可以是增强子区域甲基化的 CpG 岛发生羟基化的调节因子（图2a）。E2 诱导的主动去甲基化的第二种方式是通过 AID/APOBEC 进行 5hmC 脱氨基。ERα 通过与 AID 启动子区域的 ERE 序列结合，促进甲基化胞嘧啶残基的脱氨基(10.1084/jem.20080521)。尽管细胞核中的ERα 与 APOBEC3B 相互作用，导致胞嘧啶向尿嘧啶转变(10.1016/j.celrep.2015.08.066)，但在 E2 诱导的脱氨过程中，APOBEC 的重要性不如 AID。 综上所述，E2 在 5hmC 脱氨中发挥着关键作用，因为它与 APOBEC 酶形成复合物并激活AID 酶的表达（图 2b）。
关于 ERβ 在表观遗传过程中的作用的数据明显较少。然而，这一有限的信息表明 ERβ 具有相对简单的功能。ERβ 抑制所有三种 DNMT 酶的表达，从而抑制 DNA 甲基化。 由于 ERβ 招募 TDG 和 TET 形成复合物，因此它以与 ERα 类似的方式在主动去甲基化过程中发挥作用(10.1186/s13072-016-0055-7, 10.1080/15592294.2017.1309489)。
3. E2 诱导的组蛋白修饰
组蛋白是碱性蛋白，是构成核小体的蛋白质部分，在基因转录调控中发挥关键作用。它们在不同位点进行翻译后修饰，代表转录因子的激活或抑制标记。 组蛋白 3 (H3) 和组蛋白 4 (H4) 尤其具有长尾，因此修饰最频繁。 这些修饰通过改变组蛋白介导的 DNA 包装来影响基因转录。两种最常见的翻译后组蛋白修饰是乙酰化和甲基化。
组蛋白乙酰化是一种动态表观遗传修饰，在转录调控中发挥着关键作用。在此过程中，乙酰辅酶 A 的乙酰基被置于组蛋白上。乙酰化通常发生在赖氨酸残基上，通常被认为是转录激活信号。 ERs 在乙酰化等翻译后组蛋白修饰机制中发挥着关键作用。为了乙酰化组蛋白，ERα会招募 p300 等组蛋白乙酰化酶，该酶与 cAMP 反应元件结合蛋白家族和 p160 类固醇受体共激活剂 (SRC1/SRC2/SRC3) 形成复合物发挥作用。 Guertin 及其同事表明，ERα 与组蛋白乙酰转移酶 p300 之间通过基因组内 ERE 位点的 SRC 蛋白存在相互作用(10.1210/me.2014-1130)。此外，Frick 及其同事还证明 ERα 和 ERβ 通过 ERK1/2 信号转导途径乙酰化H3。
另一种最常见的翻译后修饰是组蛋白甲基化，它与基因转录的激活和抑制相关。例如，组蛋白 3 赖氨酸 4 (H3K4) 的甲基化与基因转录的起始相关，但组蛋白 3 赖氨酸 27 (H3K27) 的甲基化是抑制标记。 混合谱系白血病基因（MLL1、MLL2、MLL3）是有效的组蛋白甲基转移酶，它们仅甲基化 H3K4 残基。ERs 专门与 MLL2 相互作用，并在 H3K4 残基上放置甲基化标记，从而促进基因表达(10.1073/pnas.1017374108)。 除了激活之外，组蛋白甲基化还可以代表基因表达的抑制信号。当H3K27残基被甲基化时，它是基因转录的抑制信号。ERα 与多种组蛋白修饰酶（HDAC、EZH2）和组蛋白修饰复合物（NurD、PRC2）相互作用。 这些复合物用 H3 的第 27 和第 36 赖氨酸残基上的抑制性甲基取代了激活的乙酰化标记(10.7150/ijbs.8.59)。 三甲基化的 H3K27 和 H3K36 是抑制性组蛋白标记，因此抑制基因转录。
总结完这两种翻译后修饰后，值得一提的是，细胞核中存在调节 ERα 与组蛋白修饰复合物相互作用的蛋白质。其中之一是转录抑制因子TRPS1 ，它调节 ERs 与细胞核中蛋白质复合物的相互作用。 Serandour 及其同事在最近的一篇论文中表明，TRPS1 与组蛋白脱乙酰酶复合物 NurD 和 coREST 结合，两者都含有组蛋白脱乙酰酶，例如 HDAC1。通过这个过程，TRPS1 抑制基因组 ERE 位点的组蛋白脱乙酰化(10.1038/s41388-018-0312-2)。此外，TRPS1 抑制 E2 结合配体 ERα 后与DNA 结合，最终抑制不同基因的表达。很容易推测，在 TRPS1 存在的情况下，ERα 不会与组蛋白脱乙酰酶或抑制性组蛋白甲基化酶形成复合物，因此 ERα 的翻译后组蛋白修饰和 DNA 甲基化功能都被阻断。 需要进一步的实验来检验 TRSP1 在 E2 诱导的组蛋白修饰中的精确作用。
4. E2诱导的染色质重塑
染色质重塑是染色质结构从浓缩状态到转录可及状态的动态重排。这种动态变化代表了表观遗传修饰的关键机制，并通过两种不同的机制进行。 如上所述，一种机制包括翻译后组蛋白修饰，此时组蛋白乙酰转移酶、脱乙酰酶和甲基化酶影响转录机制对基因组的可及性。另一条途径受 ATP 依赖性染色质重塑复合物的调节，该复合物可重构核小体。ATP 依赖性染色质重塑酶分为四个家族：SWItch/SucroseNon-Fermentable (SWI/SNF)、imitation SWI (ISWI)、核小体重塑脱乙酰酶(NuRD/Mi-2/CHD)、染色质重塑INO80 和 SWR1 复合体 ( INO80 和 SWR1 复合物属于一个染色质重塑家族）。 不同的重塑者的 ATP 酶结构域相似，并且在不同的生物学功能中发挥着至关重要的作用。例如，ISWI 复合物对于复制后正确的染色质组装非常重要。 SWI/SNF 和 INO80 复合物参与 DNA 双链断裂的修复以及碱基切除修复机制。 SWI/SNF 相关转录激活因子，例如 BRG1和 BAF57分别在抑制基因的激活和转录启动中发挥关键作用。 INO80 复合物在胚胎发育过程中起着至关重要的作用。据报道，在胚胎干细胞中，INO80招募重要的多能性转录因子，例如OCT4、Nanog和SOX2。
最近的一项发现表明，E2 刺激在基因组的大、小尺度上都改变了染色质结构(10.1371/journal.pone.0113354)。在E2诱导的染色质重塑机制中，ERα与BRG1和BAF57相互作用，并分别促进MLL/HAT和p160组蛋白乙酰转移酶的激活。 ARID1A、ARID1B蛋白是 SWI/SNF 复合物的一部分，ARID1A 基因的缺失会导致 ARID1B 的代偿性上调； 然而，这并不能挽救 ERα 依赖性转录，这表明 ARID1A 蛋白在 ERα 相关功能中发挥着关键作用。
尽管与 ERα 没有直接相互作用，但 INO80 稳定了基因增强子区域的 ERE 位点(10.1016/j.molcel.2016.08.034)。 因此，INO80 促进 ERα 诱导的基因转录。 如前所述，ERα 可以与 NurD 复合物的 MTA1 和HDAC1 相互作用。 除了在 CpG 岛甲基化中发挥作用外，ERα还可能通过 NurD 改变染色质重塑。
5. ERα介导的表观遗传进程的关键参与者
如上所述，E2 诱导的表观遗传过程机制极其复杂。根据参与者的不同，ERα 可以抑制或促进基因表达变化。 为了更好地理解，我们在图 3 和下面总结了这些过程的关键参与者。
ERα 在 CpG 岛甲基化过程中发挥关键作用，诱导 DNMT3b 的表达。 此外，ERα 利用 NurD 复合体招募辅阻遏蛋白（如 HDAC1 和 MTA1），利用PRC2 复合体招募EZH2。 这些分子共同激活 DNMT3b 并导致 CpG 岛甲基化，从而实现ERα通过DNA甲基化有效抑制基因转录。
E2 在被动和主动去甲基化过程中也发挥着关键作用。 ERα 阻断 DNMT1 表达； 因此，新复制的DNA缺乏甲基化标记。ERα 与活性去甲基化蛋白（例如 TET2、CXXC4、CXXC5、APOBEC、AID 和 TDG）形成复合物。这些蛋白质首先修饰并随后去除 DNA 中的抑制性甲基标记，从而促进基因表达。
ERs 还与组蛋白修饰酶相互作用。 ERα 与组蛋白乙酰转移酶（例如 p160、p300 和 MLL2）相互作用。 这些蛋白质共价修饰组蛋白赖氨酸残基并改变转录活性。 H3K4修饰可以是乙酰化或甲基化，它们是激活标记；H3K27的单甲基化、二甲基化或三甲基化则是抑制标记。
如果不改变染色质对基因转录机制的可及性，就不可能调节基因活性。 ERα 与 ATP 依赖性染色质重塑剂（例如 SWI/SNF 复合物）相互作用。 BRG1 和 BAF57 蛋白具有转录起始作用并与 ERα 相互作用，类似于 INO80 蛋白复合物。 ARID1A作为乳腺癌基底细胞转变的关键蛋白(10.1038/s41588-019-0554-0)，在ERα诱导的基因转录中发挥着关键作用。
6. E2 诱导的表观遗传机制相关的生理学和病理生理学
与 E2 诱导的表观遗传机制相关的关键问题，是其引发的DNA 变化所致的生理或病理学改变。 E2 在胚胎发育、大脑和乳腺癌中引发了广泛的表观遗传变化。
组蛋白乙酰化在雌性和雄性小鼠的记忆形成中起着关键作用。 在记忆巩固过程中，ER 通过 ERK1/2 信号通路间接激活乙酰转移酶。 重要的是，在雌性小鼠的新物体识别测试中，ERα 诱导的 ERK1/2 介导的H3 组蛋白乙酰化增强了记忆。 在雄性小鼠中，尽管 E2 也能刺激新物体识别中的记忆巩固，但其分子机制尚不清楚。
ERα和ERβ在精子发生中发挥着复杂的调节作用。 ERα 抑制 HDAC 的表达，从而导致过度乙酰化，进一步导致异常的组蛋白甲基化。 ERβ 抑制所有 DNMTs，从而导致甲基化模式发生变化。 因此，睾丸中甲基化组蛋白的数量不同程度地减少。重要的是，E2诱导的表观遗传缺陷影响精子发生，并可能在E2诱导的不孕机制中发挥关键作用。
ER 通过启动子 CpG 岛甲基化导致 Ephx2 基因沉默。 这种抑制作用有助于增加心脏保护物质环氧二十碳三烯酸的水平，为女性心血管疾病风险降低提供了可能的解释。
在乳腺癌中，E2通过LCN2和IFI27的甲基化来沉默基因，在癌细胞的管腔分化中发挥重要作用。 DNA 去甲基化主要诱导乳腺癌基因转录的激活。与 ERα 阴性乳腺癌相比，ERα 阳性乳腺癌细胞甲基化程度较低(10.4161/epi.27688)。ERα 主动使胞嘧啶残基去甲基化，从而激活 APOBEC3B 和 LCN2 等基因的转录(10.1186/s40246-015-0056-9)。针对这些基因可以为未来乳腺癌疗法的开发提供一个可能的平台。 染色质重塑复合物在乳腺癌的发展过程中也是重要的参与者。 例如，ARID1A 作为 SWI/SNF 染色质重塑复合体的成员，与基因组中 ERE 位点的 ERα 相互作用，并阻止管腔细胞转变为基底细胞。 相比之下，ARID1A 的基因缺失会阻止 ERα 与 DNA 的结合，从而促进基底细胞的发育(10.1038/s41588-019-0554-0)。总之，这些结果表明 ERα 和 ARID1A 之间的相互作用可能为维持 ERα 阳性乳腺癌的内分泌治疗反应提供有效的平台。
绝经后表观遗传的变化影响女性的生理年龄。 例如，血液中甲基化 DNA 含量高于预期的女性可能会加速衰老。 尽管 E2 水平下降是女性绝经期间身体变化的原因，但 E2 在绝经后 DNA 甲基化能力升高中的作用尚不确定。 因此，需要进一步研究来探索 E2 对衰老过程中表观遗传变化的影响。
参考文献：Kovács T, Szabó-Meleg E, Ábrahám IM. Estradiol-Induced Epigenetically Mediated Mechanisms and Regulation of Gene Expression. Int J Mol Sci. 2020 Apr 30;21(9):3177.
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