NGS测序原理之illumina

下一代测序(Next generation sequencing, NGS)，也称为二代测序，是区别于Sanger测序的高通量测序技术。其中，illumina测序是目前最常见的二代测序技术之一，其单次运行可以在几十个小时内输出30万碱基到数万亿碱基的测序数据。
这次主要介绍一下illumina测序的主要流程，包括：文库制备、加载到flowcell、桥式PCR扩增、测序。其中，需要重点了解测序文库的结构。
在开始之前，可以先观看一下官方的指导视频：https://www.illumina.com.cn/science/technology/next-generation-sequencing/sequencing-technology.html
1.文库制备
根据不同的组学方法，需要采取不同的方法构建文库，通过反转录（RNA-Seq），抗体抓取（Chip-Seq）、直接提取DNA（WGS）或者其他的方式获得DNA后，通过超声波片段化，基因组DNA变成长度为200-500bp的DNA片段，随后将5'和3'接头添加到这些小片段的两端。或者直接通过Tn5酶切的同时加上接头序列，最终构建测序文库。（细节流程可参考上一篇文章https://www.jianshu.com/p/137bea6f9ff8）
2.文库加载到流动池 (Flowcell)

flowcell.png

放大的flowcell.png

流动池是吸附移动DNA片段的通道，也是核心的测序反应容器。每个流通池有8个泳道，每个泳道的表面都附有多个接头，可以匹配构建过程中DNA片段末端添加的接头。测序文库中的DNA片段在通过流动池时会随机附着在表面的泳道上。

3.桥式PCR扩增

桥式PCR.png

当文库DNA被流动池表面的接头固定后，作为模板进行桥接PCR：
1）通过聚合酶生成杂交片段的互补片段；
2）加入NaOH碱溶液后，双链分子变性，原始模板链（来自DNA文库）被流动池中的液体洗去；
3）中和溶液后，剩下的单链与附近互补的oligo引物结合，形成单链桥，在聚合酶参与下，最终形成双链桥结构。
4）通过变性，DNA分子线性化，变为两个单链拷贝；
5）经过重复的扩增和循环后，每个DNA片段最终在各自的位置聚集成束；
6）桥式扩增后，反向链被切断洗去，仅留下正向链。为防止特异性结合重新形成单链桥，3‘端被封锁。

4.测序

SBS测序.png

Illumina测序利用了与经典的桑格链终止法完全不同的方法。这种方法使用了边合成边测序（SBS）技术，进行DNA链复制时追踪检测掺入的标记核苷酸，支持大规模平行测序方式：
1）将DNA聚合酶、连接引物和4个带有碱基特异性荧光标记物的dNTP添加到反应体系中。这些 dNTP 的 3′-OH 通过化学方法保护，确保在测序过程中一次只添加一个碱基；
2）合成反应完成后，洗脱所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶；
3）加入荧光激发所需的缓冲溶液，用激光激发荧光信号，并同时记录所有的荧光信号；
4）加入化学试剂将叠氮基团与荧光基团切除，然后不断重复这个过程，直至完成目的长度的测序；
5）目的片段测序完成后，引入index 片段引物并与模板杂交，完成序列读取后被洗去。从而给测得的序列贴上标签，方便后续分析。
6）如果要进行双端测序，将模板链3’去保护后，再次进行重复桥式扩增，切去正项链后重复上述过程（唯一不同是先测index，后测目的序列）。

5.文库结构

文库结构.png

最后，我想要再简单絮叨一下基本的文库结构，主要由中间的目的片段和两端的接头序列所构成。而平时建库所说的接头序列i5，i7又主要由三个部分构成：
1）与流动槽结合的部分；
2）index序列；
3）测序引物结合的序列。
在不同的接头序列中（比如i501和i502），只有index序列是特异的，其他都是都相同的碱基序列构成。

参考：
https://www.illumina.com.cn/science/technology/next-generation-sequencing/sequencing-technology.html