“手里有粮，心里不慌”，粮食安全是“国之大者”，是国家重大经济发展战略的需要，其中玉米是重要的粮食作物，具有广阔的研究和应用前景。现在，越来越多的植物领域的研究人员也陆续的开始将单细胞转录组技术应用于玉米组织异质性、图谱、发育、抗逆、以及育种等方面的研究。接下来，我们一起看一下有关玉米气孔开闭和发育的研究。

研究背景

叶表皮作为细胞的最外层，控制着植物与其环境之间的气体和水的交换，并提供了对各种生物和非生物胁迫的保护。在表皮内，气孔决定光合和水利用效率，对变化的环境条件作出迅速反应。与双子叶气孔不同，单子叶植物气孔由两个哑铃状的保卫细胞及两侧两个辅助细胞组成。辅助细胞与保卫细胞间的协同调节能够控制气孔在对环境变化的应答过程中的快速运动，从而提高水分的利用效率。破译气孔运动和发育的分子机制为改善粮食安全提供重要理论支撑。

材料方法

1、构建玉米叶片表皮的细胞图谱

取3个玉米叶片样本进行单细胞核转录组测序，其中样品Pv2中有4999个核，Pv3a中有10229个核，Pv3b中有8903个核，基因中位数分别为552（样本Pv2）、1332（Pv3a）和1363（Pv3b），合并分析经细胞注释得到6个细胞类型，分别是PCs-A（具有花青素合成的扁平细胞），PCs-N（缺乏花青素合成的扁平细胞），MCs（叶肉细胞），GCs（气孔保卫细胞），SCs（气孔副卫细胞），BSCs（维管束鞘细胞）。

2、气孔保卫细胞有关气孔运动的相关基因表达

叶绿体是参与渗透调节的GCs的一个特征性特征。在叶片中通常有三种独特的光合细胞类型：MCs、BSCs和GCs。目前，GC叶绿体的功能仍存在争议，特别是关于光合作用和淀粉代谢在气孔运动中发挥了什么作用。研究者对三种细胞类型的叶绿体功能进行了详细分析，在MCs中，发现了光反应中标记基因的转录水平的增加，在MCs和BSCs中发现了参与c4相关周期的基因转录本。与MCs和BSCs的情况相比，GCs中编码PSII-LHCII和PSI-LHCI复合物成分的转录本的表达水平相对较低，以及C4通路的初始羧化阶段。其中只有少数被预测为deg。参与线性电子传递的铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶（FNR）的转录本低表达，而NAD (P)H脱氢酶（NDH）依赖的一个组分，亚复合物B 4（PnsB4）的光合NDH亚基高表达。说明在GCs中，光反应主要产生ATP。基于淀粉-糖假说，预测在气孔关闭过程中将在调节细胞的渗透势中发挥作用。研究者发现，在GC中编码淀粉代谢相关蛋白的基因的转录本被高表达，且在BSCs中发现不同的淀粉代谢基因的高表达，这说明淀粉的理化性质可能在BSCs和GCs之间存在差异。由于渗透调节信号控制气孔开闭的机制主要是转运蛋白来调控，所以研究者分析了连接GCs和SCs的调节转运蛋白和通道相关的基因，结果发现编码钾离子、钙离子、氯离子、铁离子、苹果酸的相关转运蛋白均在GCs中特异高表达。但也有一些其他转运蛋白在SCs中高表达，这与先前研究结果一致。

 3、GCs和SCs之间的ABA和CO2信号通路调控气孔反应

GCs可响应内源性和环境因素，如植物激素、光和细胞内二氧化碳。但这些信号通路如何整合到单子叶复合体的GCs和SCs的气孔反应中尚不清楚。为了了解ABA和CO2水平的变化如何影响气孔开闭，研究者分析了GCs和SCs的特异表达基因，其中AtCYP707A1参与了GC对ABA的降解，其转录本的表达是SCs特异性的。这表明在GCs和SCs之间发生了协调气孔关闭和打开的ABA代谢的快速动态响应。同时，研究者通过定量共聚焦显微镜测量GCs和SCs的体积，以计算细胞内ABA浓度，证明了GCs和SCs不同的ABA稳态特征可能与气孔关闭的协调有关。

二氧化碳信号是被GCs或其他类型的细胞（MCs或SCs）直接感知，以及这些信号如何在气孔关闭信号通路上汇聚，目前仍存在争议，为了评估富集SC的Zmb-CA1转录本是否可以重建SLAC1通路的OST1激活，研究者将拟南芥SLAC1、OST1、抗HIGH二氧化碳（RHC1）和抗或不抗Zmb-CA1的crna共注射到卵母细胞中。结果发现，OST1激活的SLAC1被HT1显著抑制。当Zmb-CA1、RHC1、HT1、OST1和SLAC1共表达时，HT1抑制的SLAC1活性部分恢复，表明Zmb-CA1可以将二氧化碳转化为碳酸氢盐-，并且SCs有可能参与CO2-HCO3-sink和二氧化碳传感。在干旱处理后，在突变体中观察到更明显的枯萎表型，这与水分流失率和蒸腾速率的测量结果一致。在高二氧化碳水平的条件下，zmmpk12 EMS突变体显示气孔关闭受损。这强烈说明ZmMPK12参与了玉米气孔运动的调控。

 4、玉米叶基气孔发育追踪

为了深入了解GC和SC发育的分子基础，研究者对叶基样本中进行snRNA-seq，分析得到14个亚群，经注释后主要细胞类型有：气孔、叶原基、表皮细胞、维管束细胞等。为了详细了解调控气孔发育的网络，研究者利用亚群11（气孔细胞）进行拟时序分析，发现亚群11缺乏原皮细胞（PDCs），很可能是由于样品制备过程中的混合步骤，因此，只包括从GMCs的早期发育阶段到代表幼嫩GCs（YGCs）和幼嫩SCs（YSCs）的阶段。因此，通过检查先前报道的参与者和同源基因的表达，只将保卫母细胞（GMCs）、辅助母细胞（SMCs）、YGCs和YSCs的发育轨迹定义。

5  、细胞壁相关基因在气孔发育中的潜在作用

细胞壁在气孔发育过程中经历多种动态变化，包括GMC对称分裂时形成新的细胞壁，两个YGC之间的细胞壁降解形成孔隙、气孔成熟时GC壁增厚以及伴随气孔运动的动态变。其中最有趣的一个问题是在气孔的功能寿命中，壁多糖、脂质和蛋白质是如何在GCs中协调合成、沉积、重组、修饰和降解的。为了鉴定气孔细胞壁发育中的关键基因，我们检测了细胞类型特异性标记基因列表，发现了大量具有参与细胞壁代谢的同源基因，特别参与果胶代谢的两个基因，果胶甲基酯酶53和果胶乙酰酯酶12的同源基因，主要在GMC和SMC阶段表达，参与纤维素和木质素修饰和降解的同源基因在四种细胞类型中均表达，参与与角质层代谢相关的脂质转移，优先在SMCs和GMCs中表达。

6、ZmMUTE/BZU2控制着气孔细胞壁的形成

Zmmute/bzu2突变体缺乏正常的气孔复合体，为了进一步研究MUTE在玉米气孔发育中的作用，研究者从气孔早期三个阶段的WT和ZmMUTE突变株样本中获得了大量RNA-seq数据，分别富含PDCs、GMCs和YGCs-YSCs。将叶基snRNA-seq的上调DEGs与bulk RNA-seq数据的三个发育阶段的DEGs取交集得到了28个基因，这些基因都是之前气孔细胞鉴定的标记基因。基于大量RNA-seq数据中28个基因的表达谱的层次聚类发现，有18个基因在WT的GMCs和YGCs-YSCs中转录水平升高，但在突变体的相应阶段显著下调。在这28个基因中的24个基因中检测到包括MUTE的最小E-box共识结合序列特征，这进一步缩小了ZmMUTE的候选目标。其他受ZmMUTE影响的重要调控成分，包括编码ZmSCS1、ICP4结构域蛋白、两个NAC结构域蛋白、一个蛋白磷酸酶2C家族蛋白和一个蛋白激酶的基因。这些结果详细概述了ZmMUTE在气孔发育中的调控作用，并为进一步的实验设计提供了价值。

参考文献

Sun G.L., Xia M.Z., Li J.P., Ma W., et al. The maize single-nucleus transcriptome comprehensively describes signaling networks governing movement and development of grass stomata. Plant Cell, Volume 34, Issue 5, May 2022, Pages 1890–1911.