重磅推出| mRNA m5C BS-seq技术服务，绘制单碱基分辨率m5C修饰图谱

产品介绍

m5C是RNA甲基化修饰中丰度较低的一种类型，但在肿瘤中的研究进展已经引起了广泛关注。近年来，随着高通量测序技术的发展，可以在转录组中很好的识别对包括m5C在内的各种核苷酸甲基化修饰。m5C修饰可以影响RNA的稳定性、可变剪接、翻译和转录后修饰等多个方面，从而对基因表达和细胞功能产生影响。虽然有大量关于m5C在tRNA和rRNA中的数据，但由于mRNA的丰度较低，且缺乏有效的分离纯化技术，对其在mRNA中的作用知之甚少。

为了推动mRNA m5C修饰研究，表观生物新推出单碱基分辨率的mRNA m5C BS-seq技术服务。该技术使用重亚硫酸盐对不含修饰的C进行处理，使其在PCR之后转换为T，而m5C修饰并不能进行该转换。结合体外合成全转录组无修饰RNA技术，在mRNA m5C BS-seq中加入IVT RNA作为负对照，得到高置信度的m5C位点，降低了检测结果中的假阳性率。

技术流程

分析内容

一、 质控及统计：

1. 原始数据质控

2. 比对统计

二、 m5C修饰水平概览：

1. m5C修饰平均水平统计

通过高通量测序和生物信息分析，识别甲基化富集的基因组区域

2. m5C修饰位点的注释与基因元件分布情况

通过生物信息分析利用邻近基因对m5C进行注释。并根据注释信息，绘制m5C修饰在不同基因组特征上的比例图。

3. RNA甲基化位点Motif分析

RNA上甲基化的位点，可能包含某种序列motif。RNA甲基化酶可能正是通过识别这些 motif 特异性进行甲基化修饰，从而完成转录后调控功能。成功识别了全基因组的RNA上的甲基化位点后，获取序列就能使用生物信息学的手段来搜索这些 motif，从而揭示 RNA甲基化修饰的机制。

4. 基于全转录组组甲基化图谱的聚类

各个样品之间甲基化水平的比较，同时对甲基化的位点进行聚类分析，以识别在甲基化模式上相似的样本或基因。

三、 m5C修饰修饰位点及注释

1． 差异甲基化位点（DMC）鉴定与注释

识别两个/组样品间的差异甲基化位点，结合基因组注释信息中所有基因的位置信息及各个基因元件（5utr, CDS, intron, 3utr, ncRNA, tRNA）等位置信息，鉴定DMC与哪些基因的哪些基因元件有重叠，以此来判断DMC修饰哪些基因的哪些基因元件。

2． DMC 在染色体与基因元件上的分布情况

根据DMC的位置信息，统计DMC落在哪些染⾊体上，并⽤图形展示，以了解DMC在染⾊体上的分布有偏好性。同时根据DMC的位置信息，分别统计Hyper DMC及Hypo DMC 落在哪些基因元件上。

3． DMC修饰基因的功能富集

将鉴定出的DMC所修饰的基因，利⽤GO和KEGG数据库进⾏功能富集分析。对位于CDS区的Hyper-DMC和Hypo-DMC修饰的基因进⾏功能富集分析：① 对实验组相对于对照组甲基化⽔平升⾼的DMC（All-Hyper DMC）修饰的基因做功能富集分析；② 对实验组相对于对照组甲基化⽔平降低的DMC（All-Hypo DMC）修饰的基因做功能富集分析；富集分析采⽤Fisher检验，结合BH校正。富集分析结果包括表格和图⽚两部分，其中，表格为所有富集到的GO/KEGG条⽬，包括显著和不显著的。

样本要求（需要富集polyA mRNA）

Total RNA: 50ug

细胞：1.5*107

组织：25mg

测序数据量

10G/样本

项目周期

40个工作日

参考文献：

Zhang Z, Chen T, Chen H X, et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library[J]. Nature Methods, 2021, 18(10): 1213-1222.