全新研究热点 | 植物中鉴定到首个能识别发挥双重功能抗菌肽PtRISP1的LRR-RLP受体PtRALR

植物免疫系统可以抵御病原体并预防疾病。该系统特别使用通常表现出抗菌活性或免疫调节活性的防御肽。抗菌肽 (AMP) 具有靶向并直接杀死微生物的细胞毒性活性，而免疫调节肽（也称为类似于后生动物细胞因子的植物细胞因子）通过与特定细胞表面受体结合来调节细胞免疫信号传导 。

在动物中，迄今为止描述的大多数防御肽都是双功能的，即它们表现出抗菌（或更广泛地说是杀菌，即直接杀死入侵的细菌）和免疫调节活性。这些肽被称为宿主防御肽（HDP），并作为具有高增值潜力的分子出现，因为它们的许多活性可用于治疗目的。

在植物中，仅描述了少数 HDP 候选物，并且在免疫系统中具有两种不同作用的防御肽的概念最近才出现。

目前，植物中大概有6种候选的HDP。

列出的六种肽中，MsDef1、DEF2、 CaAMP1和 RISP被报道为直接抑制微生物生长的AMP。IbACP 和 PdPR5-1已被证明具有 PE的功能，并且未测试它们的直接抗菌活性。然而，PdPR5-1 和 IbACP 的可能前体都是 TLP 超家族的成员，TLP 超家族是植物中一个充分表征的 AMP 家族。因此，PdPR5-1 和 IbACP 前体可能都表现出直接的抗菌活性抗菌活性^[1]。

2023年11月27日，bioRxiv发表了Benjamin Petre团队题为“Genetically-clustered antifungal phytocytokines and receptor proteins function together to trigger plant immune signaling”的研究论文。该论文提出杨树锈诱导肽PtRISP1在杨树中表现出诱导子活性，且对杨树锈菌有直接抗菌活性，还明确了植物中第一个能够识别抗菌肽（AMP）的LRR-RP蛋白受体RALR。https://doi.org/10.1101/2023.11.27.568785

杨柳科植物重新分为两个主要属：杨属（杨树）和柳属（柳树）。Populus trichocarpa是第一种对其基因组进行测序的树木（2006年）。

2007年，杨树叶的转录组分析揭示了一个名为锈诱导分泌肽（RISP，以下更名为PtRISP1）的孤儿基因，它是对锈病病原体感染的有效免疫反应过程中诱导最多的基因。

PtRISP1 是阳离子的、热稳定的，其成熟形式由 60 个氨基酸组成，并分泌到本塞姆氏烟草的质外体中。纯化的肽在体外和杨树上直接抑制落叶松花杨的生长，并引发杨树细胞培养物碱化。

PtRISP1基因位于LRR-RP基因旁边（RISP-ASSOCIATED LRR-RP ；PtRALR ），并且这两个基因在生物或非生物胁迫响应中共同调节，表明它们的产物之间存在功能联系。

就是说需要考虑两个问题：

• 1 评估杨柳科RISP和RALR基因家族的多样性和进化。

• 2 RALR 是否识别 RISP 来激活免疫信号。

基本结论：RISP和RALR基因属于在杨树和柳树中专门进化为簇的基因家族，并且来自杨树和柳树的两个不同的 RISP/RALR 对共同发挥作用，触发免疫信号传导。

RISP和RALR基因簇在杨柳科中特异进化

为了确定 PtRISP1 是否属于某个基因家族，我们在公开的预测蛋白质组中全面搜索了 PtRISP1 同源物。搜索总共在 7 个杨柳科物种的 8 个不同基因组中鉴定出了 24 个此类同源物（以下简称 RISP）（数据集 S2）。这 24 个RISP基因属于 9 号染色体所包含的 8 个簇，每簇包含 2 至 4 个基因（每个基因组一个簇）；除了P. trichocarpa之外，它呈现出两个簇（第二个簇存在于小支架 502 上）。24 个 RISP 家族成员的大小从 76 到 83 个氨基酸不等（成熟形式为 50 到 58 个氨基酸），并且表现出 68% 的平均百分比同一性（图1a ）。

我们在杨树和柳树之外没有发现 RISP，这表明 RISP 家族是在杨柳科物种中专门进化的。系统发育分析表明，杨树和柳树 RISP 分为两个得到充分支持的系统发育分支，这表明该家族是从一个单一祖先基因进化而来的，该基因出现在杨树和柳树的祖先物种中。6000万年前（图1a）。

RISP 预测的信号肽高度保守（平均 p 距离为 0.158 ± 0.11），而 RISP 成熟形式差异更大（平均 p 距离为 0.458 ± 0.18）。尽管存在这种序列变异性，RISP 成熟形式仍具有 4 个具有显著且保守特性的区域：

i) 具有预测的 α 螺旋结构的 N 末端区域，

ii) 亲水区域，

iii) 带正电区域（正电荷的平均净电荷） 6 ± 1.6)

iv) C 端负电荷区域（平均净电荷为负 2.7 ± 0.8）（图1a；数据集 S2）。

此外，RISP 在其成熟形式中具有四个完全保守的半胱氨酸，并呈现出较高的预测等电点（平均值为 9.4 ± 0.3）（图1a）。总而言之，这些结果表明 RISP 作为簇进化，特别是最近在杨柳科物种中，形成了一个多样化的阳离子分泌肽家族。

为了评估PtRALR在LRR-RP基因家族中如何进化，我们在公开的预测蛋白质组以及 NCBI 蛋白质数据库中全面搜索了 PtRALR 同源物。总共，该搜索仅识别出属于 10 个不同杨柳科物种的 25 个此类同源物（以下简称 RALR）（文本文件 S1）。

所有 RALR 都聚集在 LRR-RP 系统发育树内的一个完全分离的进化枝（以下简称 RALR 进化枝）中；RALR 进化枝本身存在于杨柳科 LRR-RP 的一个大进化枝中。在 RALR 进化枝内，柳树序列聚集成一个单独的子进化枝（图1b）。

有趣的是，在 25 个 RALR 中，有 8 个源自 Phytozome 门户上存在的 8 个杨柳科基因组；这 8 个RALR基因都位于RISP簇内，紧邻RISP基因的下游（图1d；数据集 S3）。

因此，迄今为止在可用的杨柳科基因组中鉴定的所有RISP和RALR基因都聚集在一起，使得这些簇包含一个RALR基因和两到四个RISP基因。总体而言，这些发现表明，包含RISP和RALR基因的簇从杨柳科物种的共同祖先簇进化并多样化。

SpRISP1 和 PtRISP1 表现出相似的生物物理特性和抗菌活性

共聚焦显微镜分析表明SpRISP1和PtRISP1（用作阳性对照）仅在质外体中积累，而不与游离GFP（用作核质标记）的信号重叠（图2a ）。

蛋白质印迹分析显示，本塞姆氏烟草叶子的质外体液中存在 RISP-mCherry 融合体和 SP-Ramya3A-mCherry（质外体对照），而细胞内 GFP 仅在总叶蛋白提取物中检测到。

SpRISP1纯化蛋白在95℃热处理10分钟后仍然可溶，类似于PtRISP1（图2b）。

蛋白质孢子下拉分析表明，与 PtRISP1（阳性对照）类似，SpRISP1 附着在 urediniospore 上，而 GFP 阴性对照则不然（图2c）。

发芽抑制实验表明，100 µM SpRISP1 溶液可抑制落叶松杨-杨树孢子的发芽，与 PtRISP1 阳性对照类似（发芽率分别为 22 % ± 7 和 8.5 % ± 6）。模拟处理的发芽率高达85%±8（图2d）。

PtRISP1 和 SpRISP1 属于其家族的两个主要且不同的亚支，这些发现表明 RISP 家族成员在整个进化过程中保留了相似的生物物理特性和活性。

在本塞姆氏烟草中，PtRALR 和 SpRALR 以 PtSOBIR1 依赖性方式积聚在质膜上

PtRALR-GFP 或 SpRALR-GFP 融合体与 PtRISP1mCherry（用作质外体标记）和 P19 蛋白（沉默抑制子）在叶细胞中共表达后发现，细胞外围有微弱的 GFP 信号，该信号与 mCherry 信号不重叠（图3）。值得注意的是，RALR-GFP 融合体的积累需要 P19 蛋白的存在，因为我们在没有 P19 的测定中观察不到荧光信号。这些初步结果表明 RALR-GFP 融合体可以在本塞姆氏烟草中积累，但水平较低，这妨碍了进一步的功能分析。

考虑到SOBIR1 的存在被证明有助于植物细胞中 LRR-RP 的积累。于是克隆了 PtSOBIR1，正如预期，PtSOBIR1 促进了 RALR-GFP 融合物在质膜上的积累，因为我们可以在没有 P19 的情况下观察到 GFP 信号。总之，这些结果表明 PtRALR 和 SpRALR 都可以在本塞姆氏烟中积聚在质膜上，并且 PtSOBIR1 的存在促进了这种积聚。由于没有检测到细胞死亡或叶片应激症状，我们推测瞬时测定适合研究 RALR 介导的免疫信号激活。

纯化的 RISP 在本塞姆氏烟草中以 RALR 依赖性方式触发免疫信号传导

纯化的 PtRISP1 对表达 PtRALR 和 PtSOBIR1 的叶盘进行外源处理，引发了 ROS 爆发，在 30 分钟时达到峰值，以及处理后 15 分钟和 30 分钟磷酸化 MAPK 的大量积累；其强度与 flg22 阳性对照触发的强度相当（图4a、b）。

另一方面，用 SpRISP1/SpRALR 对进行的相同实验显示，ROS 和磷酸化 MAPK 的积累较弱，尽管两者都显示出短暂的积累模式。

总而言之，我们得出结论，本塞姆氏烟草叶子中 RALR 和 PtSOBIR1 的共表达赋予了 RISP 响应性，表明 PtRALR 和 SpRALR 分别识别 PtRISP1 和 SpRISP1，并且这种识别快速启动免疫信号事件。

纯化的 PtRISP1 触发杨树气孔关闭

PtRISP1 的外源处理会触发快速而强烈的气孔关闭，表明 PtRISP1 足以在杨树叶中引发免疫相关反应。

展望

后生动物宿主防御肽的植物功能类似物的表征成为研究前沿

基因聚类分析可以帮助识别候选配体/受体对吗？

筛选基因组中编码细胞表面受体和小分泌蛋白的物理关联和共同调节的基因可能有助于加速配体/受体对候选物的识别。

表征非模式物种的 LRR-RP 需要付出巨大的努力来获得全基因组家族知识、生产分子材料并实施方法

RALR 是第一个被报道可识别植物细胞因子的 LRR-RP

参考资料

[1]

Petre B. Toward the Discovery of Host-Defense Peptides in Plants. Front Immunol. ;11:1825. doi: 10.3389/fimmu.2020.01825. PMID: 32973760: 2020。

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