利用高通量SPR技术进行抗体设计

表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）是一种基于光学、非标记的检测技术，可用于实时检测两个或更多分子间的结合作用。其原理主要是通过测量在特定角度下，光在金属表面上激发的表面等离子体波的共振条件变化，从而获取分子间相互作用信息。

SPR技术原理图

该技术能够实时动态监测分子之间的结合，通过分析结合动力学参数，可以非常精确地测量亲和力，而且可以提供诸如动力学、热力学等生物物理数据。SPR仪器平台的通量、灵活性及灵敏度，能够让研究者在结合研究中对生物分子的相互作用进行表征，并且可广泛的适用于不同分子，如离子、分子片段、小分子、蛋白质、病毒等。

SPR技术的优点之一是其可以进行高通量的亲和力筛选。来自东京大学的研究人员使用该技术进行了高通量的抗体亲和力筛选，将抗体的亲和力提高了100多倍[1]。他们使用短芽孢杆菌（Brevibacillus）表达系统构建了一种名为BreviA的高通量SPR分析系统，该系统可在一周之内分析384对抗原-抗体的相互作用。

该系统的工作原理如下图所示：制备好含有抗体基因的突变文库后，使用该文库转染短芽孢杆菌，并将所得菌落接种到96孔板中孵育。离心后，上清液用于SPR检测，而细胞则会被用于测序分析。

BreviA系统的工作原理

特瑞普利单抗（toripalimab）是一种抗人类PD-1抗体，属于免疫检查点抑制剂。初步的实验表明，toripalimab与小鼠PD-1 Fc融合蛋白（mPD-1-Fc）有弱亲和力。在本研究中，他们的优化目标即是使toripalimab对小鼠PD-1具有交叉反应能力。

由于抗体抗原识别的关键位置为抗体的CDR区，故抗体文库应首先考虑在CDR区进行突变。他们首先使用丙氨酸和酪氨酸分别对CDR区进行扫描突变，得到一个含有132个抗体序列的抗体文库。将该文库表达并使用BreviA系统初步筛选后，在抗体的轻链上发现了3个关键的位点，分别是：V99A、P100Y和L101A。这三个突变使得抗体的亲和力得到显著的增强，而其他突变体的亲和力要么与野生型相近，要么完全失去活性。

解离常数(koff)的下降使亲和力得到提升

以上三个突变让toripalimab对mPD-1-Fc的亲和力变强，因此它们很可能对调控抗体对mPD-1的亲和力具有重要作用。为了验证这一猜想，研究人员在这三个位点上进行了饱和突变，构建出另一个抗体文库。同样使用BreviA系统进行筛选后，在轻链上发现了两个关键突变型：V99G和P100H。由下图可见，这两个突变型在保证抗体对hPD-1的亲和力基本不变的情况下，大幅提高对mPD-1-Fc的亲和力。

饱和突变后抗体亲和力的变化

综上所述，基于SPR技术的BreviA系统可以直接和定量地评估每种抗体的亲和力，这是其他高通量相互作用筛选系统所不具备的优点。此外，该技术还可以用于优化抗体的特异性、稳定性和药代动力学等性质，在突变分析和抗体设计方面具有广泛的应用前景，可以帮助研究人员更快速、更准确地设计出具有特定性质和生物活性的抗体。

1. Matsunaga, R., Ujiie, K., Inagaki, M. et al. High-throughput analysis system of interaction kinetics for data-driven antibody design. Sci Rep 13, 19417 (2023).