文献分享31：多组学分析揭示了野生大麦在进化坡（Tabigha）的土壤适应机制

文献

2021

Advanced Sciene

Multi-Omics Analysis Reveals the Mechanism Underlying the Edaphic Adaptation in Wild Barley at Evolution Slope (Tabigha)

课题背景

（1）土壤多样性是植物进化的关键驱动力之一，用于维持物种和生态系统的多样性。土壤还为创始作物的驯化和它们朝着农业兴起和早期人类文明的形成奠定基础。此外，土壤是植物的生命基质，为它们的生长和发育提供必要的物理支持、水分、矿物元素和微生物组。土壤的物理、化学和生物性质对植物的生长和发育具有重要影响。例如，沙质土壤的水分保持能力差和频繁的干旱事件倾向于推动深根植物朝着更好的水分利用效率发展。相反，硅质土壤中降低的土壤通气性和高湿度有利于病原细菌和真菌的传播，导致根部感染和植物健康受损。因此，通过培育适应不同类型土壤的更好作物品种，可实现对土壤资源的可持续和高效利用。 

（2）大麦在数千年来一直是重要的粮食作物，现在也被用作饮料和饲料生产的原材料。在大麦的驯化过程中，特别是在现代育种和密集耕作之后，栽培大麦的遗传多样性显著减少，因此成为提高生物和非生物胁迫耐受性的大麦育种的瓶颈。野生大麦（Hordeum spontaneum）适应了不同土壤类型、水分可用性、温度和海拔的广泛环境，使其成为改良栽培大麦的理想遗传资源。

（3）在进化坡的生态地点（Tabigha，位于加利利湖北部的上加利利地区；Fig S1），两种截然不同的岩石和土壤呈现出显著的化学和物理差异：坚硬的中始新世钙质石灰岩风化成褐色干热的Terra Rossa，而毗邻的上新世玄武岩则富含硅质、湿润，并富含真菌病原体。先前的研究表明，栖息在Terra Rossa土壤中的野生大麦群体对干旱胁迫的耐受性比在Basalt土壤中生长的群体更强。有人认为进化坡（Tabigha）的野生大麦通过长期的自然选择，特别是对于土壤的独特物理、化学和微生物特性，已经演化出对独特的环境应激适应性。

然而，有关野生大麦如何获得应激耐受性的机制仍然不清楚。

Fig S1

（4）植物对环境胁迫的响应是复杂的过程，包括胁迫信号的接收、对胁迫的响应、从胁迫引起的损伤中的恢复、对胁迫的适应以及环境胁迫的代际表观遗传记忆。因此，植物需要在多组学水平上协调这些复杂过程，如染色质重塑、转录调控、转录后调节、翻译后调节、蛋白质相互作用、代谢重编程和信号转导等。由于多组学技术的快速发展，如基因组测序，全基因组亚硫酸盐测序，转录组，蛋白质组和代谢组，我们对植物对环境胁迫的响应的理解已经得到了显著的提高。这些技术中的许多已广泛应用于精选优良种质和鉴定新的等位基因、表观等位基因、蛋白质和代谢产物，以促进气候适应性作物的分子育种过程。

亮点

为了了解野生大麦如何协调多组学适应性以适应环境胁迫，作者对Terra Rossa和Basalt野生大麦群体进行了全面的多组学分析，揭示野生大麦对两种土壤类型的适应性机制，并鉴定与野生大麦土壤适应性相关的表观等位基因、等位基因和代谢产物。

结论1 Terra Rossa 和Basalt土壤环境中野生大麦的甲基化测序

为了研究DNA甲基化在土壤种群分化中的适应性差异，作者对Terra Rossa和Basalt环境中的10份野生大麦群体的代表性个体进行了全基因组重亚硫酸盐测序，共获得了1620 GB的数据。比对到参考基因组后，平均覆盖度为87.1%，平均深度为17×，最终共检测到131,408,470个mCG、97,714,324个mCHG和20,576,899个mCHH位点。

结论2 Terra Rossa 和Basalt土壤环境中野生大麦的差异甲基化

Fig 1A-C

然后，作者研究了两个野生大麦群体之间的差异甲基化区域DMR，以检测适应两种土壤类型（红土和玄武岩）的DNA甲基化变异，总共检测到121433个DMR，包括52306个CG-DMR、30720个CHG-DMR和38407个CHH-DMR（Fig 1A-C）。

Fig 1D-F

对于CG、CHG和CHH类型的DMR，平均长度分别约为66、48和21 bp，不同类型的DMR重叠很少（Fig 1C）。在两个野生大麦群体中，高甲基化和低甲基化DMR的数量相似，表明在全基因组水平上不存在整体的甲基化/去甲基化（Fig 1E）。CHG-DMRs均匀分布在每个染色体上，而CG-DMRs和CHH-DMRs在染色体的远端区域积累较多（Fig 1A）。值得注意的是，CG-DMRs和CHH-DMRs的染色体分布模式类似于基因的分布模式（Fig 1A）。此外，作者还研究了三种DMR类型在不同基因组区域（启动子、外显子、内含子、基因间区域和转座子）的分布。大量CG-DMRs和CHH-DMRs被检测在gene body和启动子区域，而较少数量的CHG-DMRs位于这些区域（Fig 1F）。

这些结果表明，CG-DMRs和CHH-DMRs在野生大麦的两个土壤种群之间的适应性功能分化和基因区域的调控中可能发挥着重要作用。

Fig 1G-H

总体而言，作者鉴定出10478个DMR影响的基因，其中包括7558个CG-DMR基因、1253个CHG-DMR基因和4237个CHH-DMR基因（Fig 1G）。在启动子区域中，大多数DMRs是CG和CHH类型，而在gene body区域，CG-DMRs是主要类型（Fig 1G）。

作者对这些基因做了GO功能富集分析，发现CG-DMRs影响的基因主要与ATP的生成、转录和翻译相关，而CHH-DMRs影响的基因富集在代谢过程中，包括碳和糖代谢以及应激响应途径（Fig 1H）。

结论3 基因组和DNA甲基化的关联

Fig S4

作者对十份野生大麦基于重测序数据做了群体结构分析、进化分析和主成分分析（Fig S4），发现来自两种土壤的基因型完全分离，而来自边界区域的品种（Basalt 99和Terra Rossa 109/110）被发现是中间类型。

Fig S5

通过计算群体分化指数Fst来估计两个野生大麦群体之间的基因组分化。高Fst值在大麦染色体3H、5H和6H上出现，表明这些基因组区域在两个野生大麦群体之间存在更明显的核苷酸差异（Fig 1A）。有趣的是，在这些区域发现了更多的DMRs。为了研究DMRs的数量与Fst值之间的关系，作者进行了这两个参数之间的相关性分析。作者发现，Fst与CG-DMRs（r = 0.392，p < 0.001），CHG-DMRs（r = 0.426，p < 0.001）和CHH-DMRs（r = 0.237，p < 0.001）的数量之间存在显著的正相关性（Fig S5A-C）。此外，作者鉴定到10478个DMR基因和2095个DSR基因，其中984个基因存在重叠（Fig S5D）。这些结果表明DMRs可能与这些野生大麦种群中的基因组变异相关。

Fig S6

Terra Rossa种群在染色体3H、5H、6H和7H上具有更高的正Tajima‘D值，而Basalt种群在染色体1H、3H、6H和7H上显示较低的负Tajima’D值（Fig S6，支持信息）。这些结果表明Terra Rossa种群处于平衡选择状态，而Basalt种群处于有向的选择状态。另外，作者发现Basalt种群的遗传多样性低于Terre Rossa种群。

结论4 两种土壤环境野生大麦的转录组和代谢组分析

Fig 2A-D

为了比较两个野生大麦群体之间的转录组差异，作者对十个品种的叶片和根进行了转录组测序，每个土壤类型包括五份材料。Terra Rossa群体的叶片和根Basalt群体相比，分别有712个和567个上调的差异表达基因以及497和752个下调的差异表达基因（Fig 2A, C）。

Fig 2E-F

GO富集和KEGG pathway富集显示，在叶片和根中的差异表达基因显著富集于“酚类物质生物合成”和“植物病原体相互作用”（Fig 2E, F）。在“酚类物质生物合成”中，Basalt品种中24个过氧化物酶编码基因的表达水平高于Terra Rossa品种（Fig 2B, D）。在“植物病原体相互作用”中，三个编码致病相关蛋白的基因在Basalt品种的根中显示出显著更高的表达水平，而在Terra Rossa品种的根中则相反（Fig 2D）。编码环核苷酸门控离子通道（CNGC4）的基因在Basalt品种的根中表达水平更高（Fig 2D）。整体而言，与来自干燥的Terra Rossa土壤的野生大麦品种相比，来自湿润的Basalt土壤的品种中与病原体抵抗相关的途径更为活跃。

相比之下，“淀粉和蔗糖代谢”中的许多差异表达基因，包括两个编码海藻糖磷酸合成酶（TPS）和海藻糖磷酸酶（TPP）的基因，在Terra Rossa群体的叶片中表达水平较高（Fig 2B）。此外，四个水解酶基因，如β-葡萄糖苷酶、β-淀粉酶和内切酶，也在Terra Rossa群体的叶片中表达水平较高（Fig 2B）。这些水解酶催化淀粉或纤维素的水解，产生葡萄糖等低分子糖类。综合这些结果表明，与Basalt群体相比，Terra Rossa群体可能具有更高的糖类生产能力。

Fig 2G-H

基因组、转录组和蛋白组的变化最终将改变代谢组，这被视为表型的镜像。因此，作者利用GC-MS和UPLC-Q-TOF/MS分析了两个野生大麦土壤群体中的代谢组。在叶片和根部分别鉴定了157和147种代谢产物。通过差异分析，作者发现Terra Rossa群体的叶片中一些主要代谢产物的浓度更高，如糖类（蔗糖、木糖、半乳糖和葡萄糖）、TCA循环中的有机酸（柠檬酸、苹果酸和富马酸）以及氨基酸（谷氨酸、天冬酰胺酸、𝛾-氨基丁酸、色氨酸）。Basalt群体的叶片和根部都显示出较高浓度的酚酰胺及其衍生物，包括香豆酰腐胺和香豆酰精胺（Fig 2G-H）。此外，在Basalt群体的根中观察到较高浓度的谷胱甘肽（Fig 2H）。

作者还发现，两个野生大麦群体之间的代谢差异可以很好地通过差异表达基因来解释。Terra Rossa品系的叶片中糖类浓度较高（Fig 2G），与水解酶基因的更高转录活性一致（Fig 2B）。Basalt群体的根中谷胱甘肽的更多积累（Fig 2H）与谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）的更高表达相关（Fig 2D）。Basalt群体中酚酰胺的更高浓度（Fig 2G-H）主要与更活跃的苯丙酮途径相关（Fig 2B、D）。总体而言，转录组和代谢组都表明，Terra Rossa群体在核心代谢方面的活性更高，而Basalt群体在次生代谢方面更为活跃。

结论5 DNA甲基化调节mRNA和lncRNA的表达

Fig 3A-C

DNA甲基化在基因表达调控中发挥着至关重要的作用。CG和CHG甲基化水平在接近TSS的上游区域急剧下降，其中“高”和“中高”组别中减少最为显著（Fig 3A）。上游区域内的前100bp的甲基化水平与野生大麦群体中基因表达水平呈负相关（Fig 3B）。与CG/CHG甲基化不同，CHH甲基化水平从上游区域的2000到300 bp逐渐增加，然后在300到100 bp处急剧减少（Fig 3A）。有趣的是，在从1000到200 bp的上游区域，CHH甲基化水平与基因表达水平呈正相关（Fig 3C）。

Fig 3D-J

为了确定高甲基化或低甲基化对个体基因表达的影响，作者在10个野生大麦品系中进行了甲基化水平和基因表达水平之间的Pearson相关性分析。结果表明，TSS上游0-200 bp的CG甲基化水平与ZLOC_11983的表达水平呈负相关，而TSS上游200-1000 bp的CHH甲基化水平与基因表达水平呈正相关（Fig 3G–J）。此外，该基因及其周围区域的SNP数量远远少于差异甲基化区域的胞嘧啶数量。因此，这表明差异基因表达可能更多地依赖于差异甲基化，而不是这些野生大麦群体中的基因组变异。

为了尽可能的降低假阳性，作者选择了差异甲基化的基因进行相关性分析。大多数相关系数没有显示统计学显著性，表明DNA甲基化水平与基因表达水平之间没有显著的相关性。然而，值得注意的是，在CG和CHG类型中，观察到的负相关的数量超过了预期值，而在CHH上下文中，观察到的正相关的数量超过了预期值。例如，ZLOC_7273和ZLOC_15741的启动子区域中的CG甲基化以及ZLOC_11578的CHG甲基化抑制了这些基因的表达，而CHH甲基化促进了MLOC_36552的表达。

此外，作者还检验了DNA甲基化与lncRNA表达之间的相关性。类似地，CG和CHG甲基化抑制了lncRNA表达，而CHH甲基化促进了lncRNA表达。然而，在lncRNA中，与mRNA相比，这些相关性要强得多（Fig 3D-F），表明DNA甲基化在调控lncRNA表达中发挥着重要作用。此外，lncRNA启动子区域的DNA甲基化的PCA显示了Basalt59/60/63和Terra Rossa161/166/169之间的明显分离。相比之下，在与mRNA相关的DNA甲基化的PCA中，并未显示这两个群体之间的分离。综合这些结果，表明DNA甲基化介导的lncRNA表达调控可能与野生大麦对不同类型土壤的适应性有关，显示出显著差异的生态学特征。

结论6 两个野生大麦群体中酚酰胺合成的差异

Fig 4

两个野生大麦群体在多组学水平上显示出酚酰胺合成途径的显著差异（Fig 4A–C）。Basalt群体中C4H、ACT2和PHT1的表达水平较高（Fig 4B），这与酚酰胺的相对较高积累一致。

作者选择了ACT2和C4H来检查基因表达、局部SNP和DNA甲基化之间的关系。Basalt76和Terra Rossa161/166中ACT2在叶片中的表达被大幅抑制，而其他品系中表达水平适中。基因表达的抑制可能与下游200 bp区域的CG和CHH甲基化或局部基因组变异有关。与所有Terra Rossa品系相比，Basalt59/60/63/76中叶片中的C4H表达要高得多。C4H的表达与局部SNPs相关，然而，在启动子区域或基因体区域中，基因表达与DNA甲基化之间没有明显的相关性。有趣的是，下游区域的大多数SNPs似乎与C4H表达相关，这表明局部基因组变异可能对相关基因的激活或抑制起到一定作用。